(Russian translation by Ksenia Skrypnik, Russian Cancer Research Center) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет обнаружить и амплифицировать специфические участки нуклеиновых кислот
из сложных биологических образцов
Эта процедура может быть использована для диагностики и позволяет определить, содержит ли исследуемый образец
последовательности нуклеиновых кислот, которые типичны для конкретных патогенов.
Также исследователи могут использовать ПЦР для того, чтобы получить большие количества ДНК
для дальнейшего изучения
Для проведения ПЦР-реакции необходимо знать последовательность нуклеотидов в амплифицируемой нуклеиновой кислоте.
Далее необходимо определить границы целевой последовательности, идентифицировав короткие последовательности
на каждом из концов противоположных нитей.
Границы последовательности, которая будет амплифицирована, окрашены в фиолетовый и зеленый цвета.
При передвижении вдоль последовательности от 5-штрих конца к 3-штрих концу в направлении
синтеза ДНК, одна цепь окрашивается в фиолетовый цвет,
а комплиментарная ей цепь - в зеленый.
Трудно показать, что происходит во время ПЦР, представляя ДНК в виде двойной спирали.
Гораздо проще понять механизм ПЦР, если воспользоваться лестничной моделью ДНК.
Кроме исследуемого образца, для проведения ПЦР-реакции нужно присутствие других компонентов.
Во-первых, необходимо наличие большоого количества каждого из четырех нуклеотидов.
Во-вторых, следует добавить короткие синтетические последовательности - ДНК - праймеры,
которые способны связываться с определенным участками амплифицируемой последовательности.
Праймеры необходимы для обеспечения специфичности реакции,
так как только участок между двумя праймерами будет амплифицирован во время ПЦР
В-третьих, для проведения реакции необходим фермент ДНК-полимераза.
Полимеразы, используемые для ПЦР, получают из бактерий,
обитающих в горячих геотермальных источниках.
Бактерия называется Thermus Aquaticus, а фермент получил название
Taq-полимеразы
Используют этот удивительный фермент из-за того, что он не теряет активности при высоких температурах,
при которых проводится ПЦР
Все описанные компоненты смешиваются в определенных пропорциях и помещаются в прибор,
называемый амплификатором.
Этот прибор может работать согласно введенной программе, циклически меняя температуру
реакционной смеси
В данной презентации температура реакции отображается в правом нижнем углу.
В первом раунде ПЦР температура реакционной смеси повышается,
комплементарные нити разделяются в результате процесса, называемого плавлением ДНК.
В дальнейшем температура понижается, пока не достигнет уровня, при котором цепи ДНК способны комплиментарно связываться.
Однако, пока в реакционной смеси присутствуют праймеры в большом количестве,
они связываются с комплиментарными участками ДНК
При дальнейшем снижении температуры, Taq-полимераза связывается со свободным концом праймера
и в направлении от 5-штрих конца к 3-штрих концу начинает добавлять нуклеотиды,
используя комплиментарную нить в качестве матрицы.
Аналогичный процесс происодит в клетках при репликации ДНК во время клеточного деления
После окончания первого раунда ПЦР в реакционной смеси на каждую амплифицируемую последовательность
будет приходится по две синтезированных копии.
Отслеживать ход амплификации вы сможете с помощью панели в левом нижнем углу.
Во втором раунде ПЦР повторяется тот же процесс.
Амплификатор резко нагревает образец для разделения комплементарных нитей ДНК,
включая те, которые только что были синтезированы.
Затем температура снижается для того, чтобы праймеры смогли связаться с матрицей
и инициировать синтез комплементарных нитей с помощью Taq-полимеразы при последующем понижении температуры
Во время третьего раунда ПЦР вновь последовательно повторяются этапы
плавления цепей, связывания праймеров при снижении температуры
и синтез новых нитей ДНК с участием Taq-полимеразы.
В конце третьего раунда на каждую целевую последовательность приходится
по восемь двунитевых копий.
В расширяющейся рамке в левом нижнем углу можно увидеть, что происходит
в каждом из последующих раундов ПЦР.
С каждым циклом количество копий целевой последовательности удваивается, так что после четырех циклов их становится
шестнадцать, после пяти - тридцать две, а после шестого раунда
число копий достигает шестидесяти четырех.
После сорока циклов праймеры и нуклеотиды будут израсходованы,
а в реакционной смеси теоретически будет присутствовать 10 ^ 12 копий целевой последовательности.
Исходная последовательность амплифицируется триллион раз.
Этот уровень амплификации достаточен для того,
чтобы увидеть фрагменты с помощью гель-электрофореза.
Большое пятно наверху геля - вся ДНК, которая присутствовала
в исследованом образце.
В образцах, отобранных на поздних этапах ПЦР, появляется более легкая полоса.
При лабораторной диагностике для детекции и определения количества амплифицированной ДНК
применяют более эффективные и простые методы, чем гель-электрофорез.
Один из таких методов описан в сопроводительных материалах.