WEBVTT

00:00:02.095 --> 00:00:10.058
(Russian translation by Ksenia Skrypnik, Russian Cancer Research Center)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет обнаружить и амплифицировать специфические участки нуклеиновых кислот

00:00:10.058 --> 00:00:13.004
из сложных биологических образцов

00:00:13.004 --> 00:00:18.051
Эта процедура может быть использована для диагностики и позволяет определить, содержит ли исследуемый образец

00:00:18.051 --> 00:00:23.047
последовательности нуклеиновых кислот, которые типичны для конкретных патогенов.

00:00:23.047 --> 00:00:31.005
Также исследователи могут использовать ПЦР для того, чтобы получить большие количества ДНК

00:00:31.005 --> 00:00:34.046
для дальнейшего изучения

00:00:34.046 --> 00:00:39.091
Для проведения ПЦР-реакции необходимо знать последовательность нуклеотидов в амплифицируемой нуклеиновой кислоте.

00:00:39.091 --> 00:00:45.072
Далее необходимо определить границы целевой последовательности, идентифицировав короткие последовательности

00:00:45.072 --> 00:00:48.019
на каждом из концов противоположных нитей.

00:00:48.019 --> 00:00:54.579
Границы последовательности, которая будет амплифицирована, окрашены в фиолетовый и зеленый цвета.

00:00:54.579 --> 00:01:00.009
При передвижении вдоль последовательности от 5-штрих конца к 3-штрих концу в направлении

00:01:00.009 --> 00:01:06.064
синтеза ДНК, одна цепь окрашивается в фиолетовый цвет,

00:01:06.064 --> 00:01:09.039
а комплиментарная ей цепь - в зеленый.

00:01:09.039 --> 00:01:15.729
Трудно показать, что происходит во время ПЦР, представляя ДНК в виде двойной спирали.

00:01:15.729 --> 00:01:22.009
Гораздо проще понять механизм ПЦР, если воспользоваться лестничной моделью ДНК.

00:01:22.009 --> 00:01:27.549
Кроме исследуемого образца, для проведения ПЦР-реакции нужно присутствие других компонентов.

00:01:27.549 --> 00:01:33.889
Во-первых, необходимо наличие большоого количества каждого из четырех нуклеотидов.

00:01:33.889 --> 00:01:40.889
Во-вторых, следует добавить короткие синтетические последовательности - ДНК - праймеры,

00:01:40.889 --> 00:01:47.006
которые способны связываться с определенным участками амплифицируемой последовательности.

00:01:47.006 --> 00:01:53.439
Праймеры необходимы для обеспечения специфичности реакции,

00:01:53.439 --> 00:01:58.929
так как только участок между двумя праймерами будет амплифицирован во время ПЦР

00:01:58.929 --> 00:02:04.069
В-третьих, для проведения реакции необходим фермент ДНК-полимераза.

00:02:04.069 --> 00:02:10.539
Полимеразы, используемые для ПЦР, получают из бактерий,

00:02:10.539 --> 00:02:14.349
обитающих в горячих геотермальных источниках.

00:02:14.349 --> 00:02:20.054
Бактерия называется Thermus Aquaticus, а фермент получил название

00:02:20.054 --> 00:02:21.079
Taq-полимеразы

00:02:21.079 --> 00:02:29.018
Используют этот удивительный фермент из-за того, что он не теряет активности при высоких температурах,

00:02:29.018 --> 00:02:31.047
при которых проводится ПЦР

00:02:31.047 --> 00:02:38.093
Все описанные компоненты смешиваются в определенных пропорциях и помещаются в прибор,

00:02:38.093 --> 00:02:40.059
называемый амплификатором.

00:02:40.059 --> 00:02:47.379
Этот прибор может работать согласно введенной программе, циклически меняя температуру

00:02:47.379 --> 00:02:49.939
реакционной смеси

00:02:49.939 --> 00:02:57.051
В данной презентации температура реакции отображается в правом нижнем углу.

00:02:57.051 --> 00:03:04.109
В первом раунде ПЦР температура реакционной смеси повышается,

00:03:04.109 --> 00:03:08.089
комплементарные нити разделяются в результате процесса, называемого плавлением ДНК.

00:03:08.089 --> 00:03:14.709
В дальнейшем температура понижается, пока не достигнет уровня, при котором цепи ДНК способны комплиментарно связываться.

00:03:14.709 --> 00:03:24.189
Однако, пока в реакционной смеси присутствуют праймеры в большом количестве,

00:03:24.189 --> 00:03:28.037
они связываются с комплиментарными участками ДНК

00:03:28.037 --> 00:03:37.249
При дальнейшем снижении температуры, Taq-полимераза связывается со свободным концом праймера

00:03:37.249 --> 00:03:44.012
и в направлении от 5-штрих конца к 3-штрих концу начинает добавлять нуклеотиды,

00:03:44.012 --> 00:03:45.359
используя комплиментарную нить в качестве матрицы.

00:03:45.359 --> 00:03:52.043
Аналогичный процесс происодит в клетках при репликации ДНК во время клеточного деления

00:03:52.043 --> 00:04:00.034
После окончания первого раунда ПЦР в реакционной смеси на каждую амплифицируемую последовательность

00:04:00.034 --> 00:04:04.499
будет приходится по две синтезированных копии.

00:04:04.499 --> 00:04:12.015
Отслеживать ход амплификации вы сможете с помощью панели в левом нижнем углу.

00:04:12.015 --> 00:04:17.069
Во втором раунде ПЦР повторяется тот же процесс.

00:04:17.069 --> 00:04:25.011
Амплификатор резко нагревает образец для разделения комплементарных нитей ДНК,

00:04:25.011 --> 00:04:28.091
включая те, которые только что были синтезированы.

00:04:28.091 --> 00:04:35.022
Затем температура снижается для того, чтобы праймеры смогли связаться с матрицей

00:04:35.022 --> 00:04:41.003
и инициировать синтез комплементарных нитей с помощью Taq-полимеразы при последующем понижении температуры

00:04:41.003 --> 00:04:47.071


00:04:47.071 --> 00:04:54.037
Во время третьего раунда ПЦР вновь последовательно повторяются этапы

00:04:54.037 --> 00:05:00.097
плавления цепей, связывания праймеров при снижении температуры

00:05:00.097 --> 00:05:06.087
и синтез новых нитей ДНК с участием Taq-полимеразы.

00:05:06.087 --> 00:05:14.094
В конце третьего раунда на каждую целевую последовательность приходится

00:05:14.094 --> 00:05:18.079
по восемь двунитевых копий.

00:05:18.079 --> 00:05:25.098
В расширяющейся рамке в левом нижнем углу можно увидеть, что происходит

00:05:25.098 --> 00:05:28.001
в каждом из последующих раундов ПЦР.

00:05:28.001 --> 00:05:34.025
С каждым циклом количество копий целевой последовательности удваивается, так что после четырех циклов их становится

00:05:34.025 --> 00:05:42.012
шестнадцать, после пяти - тридцать две, а после шестого раунда

00:05:42.012 --> 00:05:44.003
число копий достигает шестидесяти четырех.

00:05:44.003 --> 00:05:50.065
После сорока циклов праймеры и нуклеотиды будут израсходованы,

00:05:50.065 --> 00:05:57.061
а в реакционной смеси теоретически будет присутствовать 10 ^ 12 копий целевой последовательности.

00:05:57.061 --> 00:06:03.059
Исходная последовательность амплифицируется триллион раз.

00:06:03.059 --> 00:06:11.059
Этот уровень амплификации достаточен для того,

00:06:11.059 --> 00:06:14.081
чтобы увидеть фрагменты с помощью гель-электрофореза.

00:06:14.081 --> 00:06:22.088
Большое пятно наверху геля - вся ДНК, которая присутствовала

00:06:22.088 --> 00:06:24.073
в исследованом образце.

00:06:24.073 --> 00:06:34.037
В образцах, отобранных на поздних этапах ПЦР, появляется более легкая полоса.

00:06:34.037 --> 00:06:43.058
При лабораторной диагностике для детекции и определения количества амплифицированной ДНК

00:06:43.058 --> 00:06:49.008
применяют более эффективные и простые методы, чем гель-электрофорез.

00:06:49.008 --> 00:06:52.840
Один из таких методов описан в сопроводительных материалах.