WEBVTT 00:00:02.095 --> 00:00:10.058 (Spanish/Español translation by Juliana Salomón, BA, Argentina. Reviewed by Dr. Gabriela Gorelik, University of Michigan.) La reacción en cadena de la polimerasa (o PCR) puede apuntar y amplificar cualquier ácido nucleico específico de... 00:00:10.058 --> 00:00:13.004 muestras biológicas complejas. 00:00:13.004 --> 00:00:18.051 El procedimiento se puede utilizar en diagnósticos para determinar si una muestra clínica contiene... 00:00:18.051 --> 00:00:23.047 una secuencia nuclear de un patógeno especíco. 00:00:23.047 --> 00:00:31.005 O también pueden usar PCR para amplificar y marcar grandes cantidades de un determinado... 00:00:31.005 --> 00:00:34.046 gen para investigación. 00:00:34.046 --> 00:00:39.091 Para realizar la PCR se debe conocer la secuencia del ácido nucleico que desea amplificar. 00:00:39.091 --> 00:00:45.072 Luego se definen los límites de la secuencia en estudio mediante la identificación de secuencias cortas en... 00:00:45.072 --> 00:00:48.019 cada extremo de las cadenas opuestas. 00:00:48.019 --> 00:00:54.579 Aquí, los límites de la secuencia diana se indican mediante el resaltado de violeta y verde. 00:00:54.579 --> 00:01:00.009 Si se mueve desde estas secuencias en el cinco prima hacia el tres prima, la dirección... 00:01:00.009 --> 00:01:06.064 de la síntesis de ADN normal, el resaltado violeta se extiende a lo largo de una cadena y el resaltado verde... 00:01:06.064 --> 00:01:09.039 se extiende a lo largo de la cadena complementaria. 00:01:09.039 --> 00:01:15.729 Es difícil mostrar cómo funciona la PCR utilizando esta representación de doble hélice del ADN, 00:01:15.729 --> 00:01:22.009 así que se convertirá al diagrama en una imagen del ADN más fácil de entender. 00:01:22.009 --> 00:01:27.549 Además de la muestra clínica, la PCR requiere tres ingredientes. 00:01:27.549 --> 00:01:33.889 En primer lugar, debe haber un suministro masivo de cada uno de los cuatro nucleótidos. 00:01:33.889 --> 00:01:40.889 En segundo lugar, el usuario debe añadir una gran cantidad de pequeños iniciadores sintéticos diseñados... 00:01:40.889 --> 00:01:47.006 para hibridizar la secuencia de unión de cualquiera de los extremos del ADN diana. 00:01:47.006 --> 00:01:53.439 Los iniciadores son los ingredientes que conforman la reacción específica dado que sólo el ADN... 00:01:53.439 --> 00:01:58.929 que se encuentra entre estos dos cebadores será sintetizado en la reacción de PCR. 00:01:58.929 --> 00:02:04.069 En tercer lugar, la reacción requiere de la enzima ADN polimerasa 00:02:04.069 --> 00:02:10.539 Esta polimerasa para la PCR es en realidad de una bacteria que normalmente crece en el mar alrededor de... 00:02:10.539 --> 00:02:14.349 respiraderos geotérmicos calientes en el fondo del océano. 00:02:14.349 --> 00:02:20.054 La bacteria se llama Thermus aquaticus y la polimerasa se llama Taq polimerasa, 00:02:20.054 --> 00:02:21.079 para abreviar. 00:02:21.079 --> 00:02:29.018 Esta enzima exótica se utiliza porque no es inactivada por las altas temperaturas generadas... 00:02:29.018 --> 00:02:31.047 en la reacción. 00:02:31.047 --> 00:02:38.093 Todos estos elementos se mezclan en proporciones adecuadas y se colocan en un instrumento llamado... 00:02:38.093 --> 00:02:40.059 termociclador. 00:02:40.059 --> 00:02:47.379 Este instrumento puede ser programado para determinar la temperatura de la mezcla a través de una serie... 00:02:47.379 --> 00:02:49.939 de ciclos repetitivos. 00:02:49.939 --> 00:02:57.051 La temperatura de la reacción en esta demostración se presenta en el panel inferior derecho. 00:02:57.051 --> 00:03:04.109 En la primer ronda de PCR la temperatura se eleva hasta un punto en que el ADN se funde... 00:03:04.109 --> 00:03:08.089 y las cadenas complementarias se separan una de la otra. 00:03:08.089 --> 00:03:14.709 Luego, la temperatura se baja a un nivel en el que las cadenas complementarias pueden volver a asociarse. 00:03:14.709 --> 00:03:24.189 Sin embargo, dado que los cebadores están presentes en la mezcla en grandes cantidades, es más probable que... 00:03:24.189 --> 00:03:28.037 se unan a los sitios complementarios cuando las cadenas se re-asocian. 00:03:28.037 --> 00:03:37.249 A medida que la temperatura se reduce aún más, la polimerasa encuentra los extremos libres de los... 00:03:37.249 --> 00:03:44.012 iniciadores y la enzima comienza a añadir nucleótidos al extremo del cebador utilizando la cadena... 00:03:44.012 --> 00:03:45.359 complementaria como patrón. 00:03:45.359 --> 00:03:52.043 El mismo proceso se produce cuando el ADN se replica en la división celular normal. 00:03:52.043 --> 00:04:00.034 Al final de la primera ronda de la PCR habrá dos copias de la secuencia diana para cada... 00:04:00.034 --> 00:04:04.499 uno de los que estaba presente en la muestra clínica. 00:04:04.499 --> 00:04:12.015 Se puede hacer un seguimiento de la amplificación en el panel que aparecerá en la parte inferior izquierda. 00:04:12.015 --> 00:04:17.069 El mismo proceso se repite en la segunda ronda de la PCR. 00:04:17.069 --> 00:04:25.011 El termociclador calienta la muestra para separar las cadenas complementarias de ADN, 00:04:25.011 --> 00:04:28.091 incluyendo aquellas que acaban de ser sintetizadas. 00:04:28.091 --> 00:04:35.022 La temperatura se baja para permitir que los iniciadores se unan a sus sitios específicos y para que la... 00:04:35.022 --> 00:04:41.003 Taq polimerasa sintetice las cadenas complementarias cuando la temperatura se baje... 00:04:41.003 --> 00:04:47.071 de nuevo. 00:04:47.071 --> 00:04:54.037 En la tercera ronda se produce el mismo ciclo con la temperatura de la reacción, se sube para la fusión de... 00:04:54.037 --> 00:05:00.097 las cadenas, y luego se baja para la unión de los iniciadores y una nueva síntesis de la cadena ocurre cuando... 00:05:00.097 --> 00:05:06.087 las cadenas están preparadas para que la ADN polimerasa inicie la adición de nucleótidos. 00:05:06.087 --> 00:05:14.094 Al final de la tercera ronda habrá ocho copias de doble cadena de la secuencia diana, 00:05:14.094 --> 00:05:18.079 donde originalmente había solo una. 00:05:18.079 --> 00:05:25.098 El marco de la ampliación de la parte inferior izquierda mostrará ahora lo que ocurre con los ciclos sucesivos 00:05:25.098 --> 00:05:28.001 de la PCR. 00:05:28.001 --> 00:05:34.025 Con cada ciclo, el número de copias de la secuencia diana se duplica, por lo que habrá dieciséis... 00:05:34.025 --> 00:05:42.012 copias después de cuatro ciclos, treinta y dos copias después de cinco ciclos, y sesenta y cuatro copias después... 00:05:42.012 --> 00:05:44.003 de seis ciclos. 00:05:44.003 --> 00:05:50.065 En el momento que el termociclador ha completado cuarenta ciclos los iniciadores y los nucleótidos... 00:05:50.065 --> 00:05:57.061 probablemente se agotarán, pero en teoría quedarán diez a la doce (10e12) copias 00:05:57.061 --> 00:06:03.059 La secuencia diana se habrá amplificado un billón de veces. 00:06:03.059 --> 00:06:11.059 Este nivel de amplificación produce suficiente cantidad de ADN específico como para poder visualizarlo... 00:06:11.059 --> 00:06:14.081 en un gel por electroforesis. 00:06:14.081 --> 00:06:22.088 La banda grande de ADN en la parte superior del gel representa el complejo de ADN que estaba presente... 00:06:22.088 --> 00:06:24.073 en la muestra clínica. 00:06:24.073 --> 00:06:34.037 Sin embargo, una nueva banda más pequeña aparece en las muestras tomadas de los últimos ciclos de la PCR. 00:06:34.037 --> 00:06:43.058 Para los propósitos de diagnóstico de laboratorio el ADN amplificado puede ser detectado y cuantificado por métodos... 00:06:43.058 --> 00:06:49.008 más eficientes y más simples que el gel por electrophoresis. 00:06:49.008 --> 00:06:52.840 Uno de estos métodos se describe en un programa adjunto.