1 00:00:02,095 --> 00:00:10,058 (Spanish/Español translation by Juliana Salomón, BA, Argentina. Reviewed by Dr. Gabriela Gorelik, University of Michigan.) La reacción en cadena de la polimerasa (o PCR) puede apuntar y amplificar cualquier ácido nucleico específico de... 2 00:00:10,058 --> 00:00:13,004 muestras biológicas complejas. 3 00:00:13,004 --> 00:00:18,051 El procedimiento se puede utilizar en diagnósticos para determinar si una muestra clínica contiene... 4 00:00:18,051 --> 00:00:23,047 una secuencia nuclear de un patógeno especíco. 5 00:00:23,047 --> 00:00:31,005 O también pueden usar PCR para amplificar y marcar grandes cantidades de un determinado... 6 00:00:31,005 --> 00:00:34,046 gen para investigación. 7 00:00:34,046 --> 00:00:39,091 Para realizar la PCR se debe conocer la secuencia del ácido nucleico que desea amplificar. 8 00:00:39,091 --> 00:00:45,072 Luego se definen los límites de la secuencia en estudio mediante la identificación de secuencias cortas en... 9 00:00:45,072 --> 00:00:48,019 cada extremo de las cadenas opuestas. 10 00:00:48,019 --> 00:00:54,579 Aquí, los límites de la secuencia diana se indican mediante el resaltado de violeta y verde. 11 00:00:54,579 --> 00:01:00,009 Si se mueve desde estas secuencias en el cinco prima hacia el tres prima, la dirección... 12 00:01:00,009 --> 00:01:06,064 de la síntesis de ADN normal, el resaltado violeta se extiende a lo largo de una cadena y el resaltado verde... 13 00:01:06,064 --> 00:01:09,039 se extiende a lo largo de la cadena complementaria. 14 00:01:09,039 --> 00:01:15,729 Es difícil mostrar cómo funciona la PCR utilizando esta representación de doble hélice del ADN, 15 00:01:15,729 --> 00:01:22,009 así que se convertirá al diagrama en una imagen del ADN más fácil de entender. 16 00:01:22,009 --> 00:01:27,549 Además de la muestra clínica, la PCR requiere tres ingredientes. 17 00:01:27,549 --> 00:01:33,889 En primer lugar, debe haber un suministro masivo de cada uno de los cuatro nucleótidos. 18 00:01:33,889 --> 00:01:40,889 En segundo lugar, el usuario debe añadir una gran cantidad de pequeños iniciadores sintéticos diseñados... 19 00:01:40,889 --> 00:01:47,006 para hibridizar la secuencia de unión de cualquiera de los extremos del ADN diana. 20 00:01:47,006 --> 00:01:53,439 Los iniciadores son los ingredientes que conforman la reacción específica dado que sólo el ADN... 21 00:01:53,439 --> 00:01:58,929 que se encuentra entre estos dos cebadores será sintetizado en la reacción de PCR. 22 00:01:58,929 --> 00:02:04,069 En tercer lugar, la reacción requiere de la enzima ADN polimerasa 23 00:02:04,069 --> 00:02:10,539 Esta polimerasa para la PCR es en realidad de una bacteria que normalmente crece en el mar alrededor de... 24 00:02:10,539 --> 00:02:14,349 respiraderos geotérmicos calientes en el fondo del océano. 25 00:02:14,349 --> 00:02:20,054 La bacteria se llama Thermus aquaticus y la polimerasa se llama Taq polimerasa, 26 00:02:20,054 --> 00:02:21,079 para abreviar. 27 00:02:21,079 --> 00:02:29,018 Esta enzima exótica se utiliza porque no es inactivada por las altas temperaturas generadas... 28 00:02:29,018 --> 00:02:31,047 en la reacción. 29 00:02:31,047 --> 00:02:38,093 Todos estos elementos se mezclan en proporciones adecuadas y se colocan en un instrumento llamado... 30 00:02:38,093 --> 00:02:40,059 termociclador. 31 00:02:40,059 --> 00:02:47,379 Este instrumento puede ser programado para determinar la temperatura de la mezcla a través de una serie... 32 00:02:47,379 --> 00:02:49,939 de ciclos repetitivos. 33 00:02:49,939 --> 00:02:57,051 La temperatura de la reacción en esta demostración se presenta en el panel inferior derecho. 34 00:02:57,051 --> 00:03:04,109 En la primer ronda de PCR la temperatura se eleva hasta un punto en que el ADN se funde... 35 00:03:04,109 --> 00:03:08,089 y las cadenas complementarias se separan una de la otra. 36 00:03:08,089 --> 00:03:14,709 Luego, la temperatura se baja a un nivel en el que las cadenas complementarias pueden volver a asociarse. 37 00:03:14,709 --> 00:03:24,189 Sin embargo, dado que los cebadores están presentes en la mezcla en grandes cantidades, es más probable que... 38 00:03:24,189 --> 00:03:28,037 se unan a los sitios complementarios cuando las cadenas se re-asocian. 39 00:03:28,037 --> 00:03:37,249 A medida que la temperatura se reduce aún más, la polimerasa encuentra los extremos libres de los... 40 00:03:37,249 --> 00:03:44,012 iniciadores y la enzima comienza a añadir nucleótidos al extremo del cebador utilizando la cadena... 41 00:03:44,012 --> 00:03:45,359 complementaria como patrón. 42 00:03:45,359 --> 00:03:52,043 El mismo proceso se produce cuando el ADN se replica en la división celular normal. 43 00:03:52,043 --> 00:04:00,034 Al final de la primera ronda de la PCR habrá dos copias de la secuencia diana para cada... 44 00:04:00,034 --> 00:04:04,499 uno de los que estaba presente en la muestra clínica. 45 00:04:04,499 --> 00:04:12,015 Se puede hacer un seguimiento de la amplificación en el panel que aparecerá en la parte inferior izquierda. 46 00:04:12,015 --> 00:04:17,069 El mismo proceso se repite en la segunda ronda de la PCR. 47 00:04:17,069 --> 00:04:25,011 El termociclador calienta la muestra para separar las cadenas complementarias de ADN, 48 00:04:25,011 --> 00:04:28,091 incluyendo aquellas que acaban de ser sintetizadas. 49 00:04:28,091 --> 00:04:35,022 La temperatura se baja para permitir que los iniciadores se unan a sus sitios específicos y para que la... 50 00:04:35,022 --> 00:04:41,003 Taq polimerasa sintetice las cadenas complementarias cuando la temperatura se baje... 51 00:04:41,003 --> 00:04:47,071 de nuevo. 52 00:04:47,071 --> 00:04:54,037 En la tercera ronda se produce el mismo ciclo con la temperatura de la reacción, se sube para la fusión de... 53 00:04:54,037 --> 00:05:00,097 las cadenas, y luego se baja para la unión de los iniciadores y una nueva síntesis de la cadena ocurre cuando... 54 00:05:00,097 --> 00:05:06,087 las cadenas están preparadas para que la ADN polimerasa inicie la adición de nucleótidos. 55 00:05:06,087 --> 00:05:14,094 Al final de la tercera ronda habrá ocho copias de doble cadena de la secuencia diana, 56 00:05:14,094 --> 00:05:18,079 donde originalmente había solo una. 57 00:05:18,079 --> 00:05:25,098 El marco de la ampliación de la parte inferior izquierda mostrará ahora lo que ocurre con los ciclos sucesivos 58 00:05:25,098 --> 00:05:28,001 de la PCR. 59 00:05:28,001 --> 00:05:34,025 Con cada ciclo, el número de copias de la secuencia diana se duplica, por lo que habrá dieciséis... 60 00:05:34,025 --> 00:05:42,012 copias después de cuatro ciclos, treinta y dos copias después de cinco ciclos, y sesenta y cuatro copias después... 61 00:05:42,012 --> 00:05:44,003 de seis ciclos. 62 00:05:44,003 --> 00:05:50,065 En el momento que el termociclador ha completado cuarenta ciclos los iniciadores y los nucleótidos... 63 00:05:50,065 --> 00:05:57,061 probablemente se agotarán, pero en teoría quedarán diez a la doce (10e12) copias 64 00:05:57,061 --> 00:06:03,059 La secuencia diana se habrá amplificado un billón de veces. 65 00:06:03,059 --> 00:06:11,059 Este nivel de amplificación produce suficiente cantidad de ADN específico como para poder visualizarlo... 66 00:06:11,059 --> 00:06:14,081 en un gel por electroforesis. 67 00:06:14,081 --> 00:06:22,088 La banda grande de ADN en la parte superior del gel representa el complejo de ADN que estaba presente... 68 00:06:22,088 --> 00:06:24,073 en la muestra clínica. 69 00:06:24,073 --> 00:06:34,037 Sin embargo, una nueva banda más pequeña aparece en las muestras tomadas de los últimos ciclos de la PCR. 70 00:06:34,037 --> 00:06:43,058 Para los propósitos de diagnóstico de laboratorio el ADN amplificado puede ser detectado y cuantificado por métodos... 71 00:06:43,058 --> 00:06:49,008 más eficientes y más simples que el gel por electrophoresis. 72 00:06:49,008 --> 00:06:52,840 Uno de estos métodos se describe en un programa adjunto.