(Spanish/Español translation by Juliana Salomón, BA, Argentina. Reviewed by Dr. Gabriela Gorelik, University of Michigan.) La reacción en cadena de la polimerasa (o PCR) puede apuntar y amplificar cualquier ácido nucleico específico de...
muestras biológicas complejas.
El procedimiento se puede utilizar en diagnósticos para determinar si una muestra clínica contiene...
una secuencia nuclear de un patógeno especíco.
O también pueden usar PCR para amplificar y marcar grandes cantidades de un determinado...
gen para investigación.
Para realizar la PCR se debe conocer la secuencia del ácido nucleico que desea amplificar.
Luego se definen los límites de la secuencia en estudio mediante la identificación de secuencias cortas en...
cada extremo de las cadenas opuestas.
Aquí, los límites de la secuencia diana se indican mediante el resaltado de violeta y verde.
Si se mueve desde estas secuencias en el cinco prima hacia el tres prima, la dirección...
de la síntesis de ADN normal, el resaltado violeta se extiende a lo largo de una cadena y el resaltado verde...
se extiende a lo largo de la cadena complementaria.
Es difícil mostrar cómo funciona la PCR utilizando esta representación de doble hélice del ADN,
así que se convertirá al diagrama en una imagen del ADN más fácil de entender.
Además de la muestra clínica, la PCR requiere tres ingredientes.
En primer lugar, debe haber un suministro masivo de cada uno de los cuatro nucleótidos.
En segundo lugar, el usuario debe añadir una gran cantidad de pequeños iniciadores sintéticos diseñados...
para hibridizar la secuencia de unión de cualquiera de los extremos del ADN diana.
Los iniciadores son los ingredientes que conforman la reacción específica dado que sólo el ADN...
que se encuentra entre estos dos cebadores será sintetizado en la reacción de PCR.
En tercer lugar, la reacción requiere de la enzima ADN polimerasa
Esta polimerasa para la PCR es en realidad de una bacteria que normalmente crece en el mar alrededor de...
respiraderos geotérmicos calientes en el fondo del océano.
La bacteria se llama Thermus aquaticus y la polimerasa se llama Taq polimerasa,
para abreviar.
Esta enzima exótica se utiliza porque no es inactivada por las altas temperaturas generadas...
en la reacción.
Todos estos elementos se mezclan en proporciones adecuadas y se colocan en un instrumento llamado...
termociclador.
Este instrumento puede ser programado para determinar la temperatura de la mezcla a través de una serie...
de ciclos repetitivos.
La temperatura de la reacción en esta demostración se presenta en el panel inferior derecho.
En la primer ronda de PCR la temperatura se eleva hasta un punto en que el ADN se funde...
y las cadenas complementarias se separan una de la otra.
Luego, la temperatura se baja a un nivel en el que las cadenas complementarias pueden volver a asociarse.
Sin embargo, dado que los cebadores están presentes en la mezcla en grandes cantidades, es más probable que...
se unan a los sitios complementarios cuando las cadenas se re-asocian.
A medida que la temperatura se reduce aún más, la polimerasa encuentra los extremos libres de los...
iniciadores y la enzima comienza a añadir nucleótidos al extremo del cebador utilizando la cadena...
complementaria como patrón.
El mismo proceso se produce cuando el ADN se replica en la división celular normal.
Al final de la primera ronda de la PCR habrá dos copias de la secuencia diana para cada...
uno de los que estaba presente en la muestra clínica.
Se puede hacer un seguimiento de la amplificación en el panel que aparecerá en la parte inferior izquierda.
El mismo proceso se repite en la segunda ronda de la PCR.
El termociclador calienta la muestra para separar las cadenas complementarias de ADN,
incluyendo aquellas que acaban de ser sintetizadas.
La temperatura se baja para permitir que los iniciadores se unan a sus sitios específicos y para que la...
Taq polimerasa sintetice las cadenas complementarias cuando la temperatura se baje...
de nuevo.
En la tercera ronda se produce el mismo ciclo con la temperatura de la reacción, se sube para la fusión de...
las cadenas, y luego se baja para la unión de los iniciadores y una nueva síntesis de la cadena ocurre cuando...
las cadenas están preparadas para que la ADN polimerasa inicie la adición de nucleótidos.
Al final de la tercera ronda habrá ocho copias de doble cadena de la secuencia diana,
donde originalmente había solo una.
El marco de la ampliación de la parte inferior izquierda mostrará ahora lo que ocurre con los ciclos sucesivos
de la PCR.
Con cada ciclo, el número de copias de la secuencia diana se duplica, por lo que habrá dieciséis...
copias después de cuatro ciclos, treinta y dos copias después de cinco ciclos, y sesenta y cuatro copias después...
de seis ciclos.
En el momento que el termociclador ha completado cuarenta ciclos los iniciadores y los nucleótidos...
probablemente se agotarán, pero en teoría quedarán diez a la doce (10e12) copias
La secuencia diana se habrá amplificado un billón de veces.
Este nivel de amplificación produce suficiente cantidad de ADN específico como para poder visualizarlo...
en un gel por electroforesis.
La banda grande de ADN en la parte superior del gel representa el complejo de ADN que estaba presente...
en la muestra clínica.
Sin embargo, una nueva banda más pequeña aparece en las muestras tomadas de los últimos ciclos de la PCR.
Para los propósitos de diagnóstico de laboratorio el ADN amplificado puede ser detectado y cuantificado por métodos...
más eficientes y más simples que el gel por electrophoresis.
Uno de estos métodos se describe en un programa adjunto.