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Format: Layer, Start, End, Style, Name, MarginL, MarginR, MarginV, Effect, Text
Dialogue: 0,0:00:02.03,0:00:09.06,Default,,0000,0000,0000,,(Portuguese/Português translation by Ana Julia Perrotti-Garcia, FFLCH USP SP, Freelance Translator & Interpreter)\NEste programa mostra como um ácido nucleico específico pode ser detectado e quantificado
Dialogue: 0,0:00:09.06,0:00:12.54,Default,,0000,0000,0000,,numa amostra clínical, utilizando PCR.
Dialogue: 0,0:00:12.54,0:00:19.95,Default,,0000,0000,0000,,Isto é feito pela detecção do acúmulo de produtos amplificados por PCR
Dialogue: 0,0:00:19.95,0:00:23.37,Default,,0000,0000,0000,,conforme são gerados na reação.
Dialogue: 0,0:00:23.37,0:00:29.10,Default,,0000,0000,0000,,E, assim, o processo é chamado "PCR em tempo-real" (RT-PCR).
Dialogue: 0,0:00:29.10,0:00:38.06,Default,,0000,0000,0000,,Para entender como os produtos amplificados por PCR, também chamados amplicons, são detectados em tempo real,
Dialogue: 0,0:00:38.06,0:00:46.05,Default,,0000,0000,0000,,primeiro, vamos analisar os eventos que ocorrem durante o ciclo normal da PCR.
Dialogue: 0,0:00:46.05,0:00:53.04,Default,,0000,0000,0000,,Lembre-se que o primeiro passo de cada ciclo de PCR consiste em elevar a temperatura da reação e
Dialogue: 0,0:00:53.04,0:00:55.09,Default,,0000,0000,0000,,derreter o DNA de dupla-fita.
Dialogue: 0,0:00:55.09,0:01:03.01,Default,,0000,0000,0000,,Em seguida, quando a temperatura é reduzida, os primers específicos se ligam
Dialogue: 0,0:01:03.01,0:01:06.08,Default,,0000,0000,0000,,às sequências de cada extremidade do DNA alvo.
Dialogue: 0,0:01:06.08,0:01:15.01,Default,,0000,0000,0000,,O DNA intermediário pode então ser sintetizado por reação da polimerase em sentidos opostos.
Dialogue: 0,0:01:15.01,0:01:21.73,Default,,0000,0000,0000,,Como resultado, são produzidas duas cópias com dupla-fita do DNA alvo,
Dialogue: 0,0:01:21.73,0:01:23.03,Default,,0000,0000,0000,,onde inicialmente havia apenas uma.
Dialogue: 0,0:01:23.03,0:01:30.23,Default,,0000,0000,0000,,Se tiver dúvidas sobre este processo básico, pode ser uma boa ideia
Dialogue: 0,0:01:30.23,0:01:35.50,Default,,0000,0000,0000,,rever o programa básico sobre PCR.
Dialogue: 0,0:01:35.50,0:01:41.07,Default,,0000,0000,0000,,Para detectar a geração de novos amplicons em tempo real, a reação de PCR requer
Dialogue: 0,0:01:41.07,0:01:50.02,Default,,0000,0000,0000,,algo mais: uma sonda de DNA de cadeia simples, desenvolvida para hibridizar-se
Dialogue: 0,0:01:50.02,0:01:54.33,Default,,0000,0000,0000,,com a parte da sequência de DNA sintetizada entre os dois primers.
Dialogue: 0,0:01:54.33,0:02:02.53,Default,,0000,0000,0000,,No entanto, ao contrário dos primers, esta sonda é especialmente mais definida.
Dialogue: 0,0:02:02.53,0:02:11.00,Default,,0000,0000,0000,,Um dos seus nucleotídeos é marcado com uma molécula fluorescente e um outro nucleótido é marcado
Dialogue: 0,0:02:11.00,0:02:16.00,Default,,0000,0000,0000,,com uma molécula quencher fluorescente.
Dialogue: 0,0:02:16.00,0:02:23.06,Default,,0000,0000,0000,,O quencher absorve rapidamente qualquer energia luminosa emitida pela molécula fluorescente,
Dialogue: 0,0:02:23.06,0:02:27.46,Default,,0000,0000,0000,,desde que esteja bem próxima.
Dialogue: 0,0:02:27.46,0:02:36.16,Default,,0000,0000,0000,,Agora, vamos ver o que acontece quando este ingrediente adicional está presente
Dialogue: 0,0:02:36.16,0:02:39.77,Default,,0000,0000,0000,,durante um ciclo de PCR.
Dialogue: 0,0:02:39.77,0:02:44.10,Default,,0000,0000,0000,,Outros primers ligam-se às cadeias separadas de DNA.
Dialogue: 0,0:02:44.10,0:02:49.03,Default,,0000,0000,0000,,A sonda também encontra seus locais complementares entre elas.
Dialogue: 0,0:02:49.03,0:02:56.63,Default,,0000,0000,0000,,A enzima que sintetiza DNA novo nas extremidades dos primers também têm uma segunda atividade:
Dialogue: 0,0:02:56.63,0:03:00.72,Default,,0000,0000,0000,,uma atividade exonuclear.
Dialogue: 0,0:03:00.72,0:03:07.41,Default,,0000,0000,0000,,Assim, quando encontra uma dupla fita de DNA, ela desmonta a fita
Dialogue: 0,0:03:07.41,0:03:12.10,Default,,0000,0000,0000,,que está em seu caminho, e substitui todos os nucleotídeos.
Dialogue: 0,0:03:12.10,0:03:18.38,Default,,0000,0000,0000,,Quando a polimerase passa pela sonda, percebe que o nucleotídeo contendo
Dialogue: 0,0:03:18.38,0:03:24.08,Default,,0000,0000,0000,,o marcador fluorescente e com quencher estão separados um do outro.
Dialogue: 0,0:03:24.08,0:03:32.30,Default,,0000,0000,0000,,Na ausência de um quencher próximo, a molécula fluorescente pode emitir luz detectável
Dialogue: 0,0:03:32.30,0:03:34.10,Default,,0000,0000,0000,,quando estimulada.
Dialogue: 0,0:03:34.10,0:03:41.10,Default,,0000,0000,0000,,Cada vez que um amplicon é produzido, um marcador fluorescente é libertado de um quencher próximo
Dialogue: 0,0:03:41.10,0:03:43.02,Default,,0000,0000,0000,,.
Dialogue: 0,0:03:43.02,0:03:50.30,Default,,0000,0000,0000,,Portanto, assim como o número de amplicons duplica em cada ciclo de PCR,
Dialogue: 0,0:03:50.30,0:03:52.96,Default,,0000,0000,0000,,a quantidade de energia fluorescente emitida também duplica.
Dialogue: 0,0:03:52.96,0:04:00.06,Default,,0000,0000,0000,,Esta geração de luz pode ser monitorada durante a reação de PCR
Dialogue: 0,0:04:00.06,0:04:02.01,Default,,0000,0000,0000,,por um termociclador equipado com fluorímetro.
Dialogue: 0,0:04:02.01,0:04:08.69,Default,,0000,0000,0000,,Então, se iniciamos com uma amostra clínica que tenha apenas uma cópia do DNA alvo,
Dialogue: 0,0:04:08.69,0:04:15.05,Default,,0000,0000,0000,,podem ser necessários mais de 40 ciclos antes dos amplicons serem detectados por um fluorímetro
Dialogue: 0,0:04:15.05,0:04:16.05,Default,,0000,0000,0000,,em um termociclador especializado.
Dialogue: 0,0:04:16.05,0:04:24.01,Default,,0000,0000,0000,,Mas, se a amostra original continha 32 vezes mais cópias do DNA alvo,
Dialogue: 0,0:04:24.01,0:04:30.07,Default,,0000,0000,0000,,Seriam necessários 5 ciclos de PCR a menos para ocorrer a detecção fluorimétrica.
Dialogue: 0,0:04:30.07,0:04:38.00,Default,,0000,0000,0000,,E se houver mais 1.024 sequências de DNA alvo na amostra original,
Dialogue: 0,0:04:38.00,0:04:42.14,Default,,0000,0000,0000,,então a fluorescência seria detectada 10 ciclos antes.
Dialogue: 0,0:04:42.14,0:04:48.02,Default,,0000,0000,0000,,Assim, a quantidade de DNA específico na amostra clínica é determinada referindo-se
Dialogue: 0,0:04:48.02,0:04:56.82,Default,,0000,0000,0000,,ao ciclo de PCR em que a quantidade de fluorescência ultrapassa o limite de detecção.
Dialogue: 0,0:04:56.82,0:05:04.04,Default,,0000,0000,0000,,RT-PCR é mais frequentemente usada para quantificar a carga viral no sangue de pacientes
Dialogue: 0,0:05:04.04,0:05:08.45,Default,,0000,0000,0000,,com HIV, hepatite B e outros vírus.
Dialogue: 0,0:05:08.45,0:05:19.29,Default,,0000,0000,0000,,Mas o HIV é um RNA vírus, que não tem DNA, e seu RNA é de cadeia simples.
Dialogue: 0,0:05:19.29,0:05:23.06,Default,,0000,0000,0000,,Então, como este método funciona?
Dialogue: 0,0:05:23.06,0:05:30.06,Default,,0000,0000,0000,,A resposta é que o RNA de um RNA vírus pode ser quantificado depois de ter sido copiado
Dialogue: 0,0:05:30.06,0:05:34.00,Default,,0000,0000,0000,,e convertido em DNA de dupla fita.
Dialogue: 0,0:05:34.00,0:05:42.39,Default,,0000,0000,0000,,Esta animação mostra como isso é feito. Em primeiro lugar, o RNA viral é liberado
Dialogue: 0,0:05:42.39,0:05:43.51,Default,,0000,0000,0000,,do vírion.
Dialogue: 0,0:05:43.51,0:05:51.10,Default,,0000,0000,0000,,Então, uma cadeia de DNA complementar é sintetizada a partir do RNA viral purificado
Dialogue: 0,0:05:51.10,0:05:56.02,Default,,0000,0000,0000,,utilizando transcriptase reversa, assim como faz na replicação natural.
Dialogue: 0,0:05:56.02,0:06:06.02,Default,,0000,0000,0000,,Em alguns protocolos, uma enzima RNAse especializada é adicionada para clivar o RNA
Dialogue: 0,0:06:06.02,0:06:08.00,Default,,0000,0000,0000,,permitir que seja degradado.
Dialogue: 0,0:06:08.00,0:06:15.54,Default,,0000,0000,0000,,Com ou sem essa parte do processo, o passo seguinte ocorre quando uma DNA polimerase
Dialogue: 0,0:06:15.54,0:06:22.07,Default,,0000,0000,0000,,e um primer geram uma fita de DNA complementar, como na PCR.
Dialogue: 0,0:06:22.07,0:06:31.67,Default,,0000,0000,0000,,No final desta reação, uma fita simples de RNA viral foi convertida em um DNA de dupla fita
Dialogue: 0,0:06:31.67,0:06:37.02,Default,,0000,0000,0000,,que possui a mesma sequência de bases nucleotídicas.
Dialogue: 0,0:06:37.02,0:06:42.61,Default,,0000,0000,0000,,A PCR qualitativa pode prosseguir tal como descrito anteriormente.