WEBVTT 00:00:02.031 --> 00:00:09.061 (French translation by Samuel Scherber) Ce programme vous démontre comment on peut détecter un acide nucléique spécifique dans un échantillon clinique 00:00:09.061 --> 00:00:12.539 et le quantifier en utilisant la PCR. 00:00:12.539 --> 00:00:19.949 Ceci est réalisé par la détection de l'accumulation des produits de PCR amplifiés dans le même temps qu'ils sont 00:00:19.949 --> 00:00:23.369 générés par la réaction. 00:00:23.369 --> 00:00:29.098 Et donc, le processus s'appelle 'en temps réel', ou RT-PCR. 00:00:29.098 --> 00:00:38.059 Pour comprendre comment les produits amplifiés par PCR, autrement appellés 'amplicons,' sont détectés en temps réel, 00:00:38.059 --> 00:00:46.047 allons voir d'abord les événements qui se déroulent au cours d'un cycle normal de PCR. 00:00:46.047 --> 00:00:53.036 Rappelons que la première étape d'un cycle de PCR est d'augmenter la température de réaction et faire deshybrider 00:00:53.036 --> 00:00:55.094 l'ADN double brin. 00:00:55.094 --> 00:01:03.007 Puis, lorsque la température est suffisamment abaissée, les amorces spécifiques peuvent s'hybrider aux séquences situées à 00:01:03.007 --> 00:01:06.084 chaque extrémité de l'ADN cible. 00:01:06.084 --> 00:01:15.007 L'ADN intermédiaire peut alors être synthétisé par la réaction de polymérase dans les directions opposées. 00:01:15.007 --> 00:01:21.729 En outre, on a obtenu deux copies double brin de l'ADN cible, alors que l'on en a commencé 00:01:21.729 --> 00:01:23.028 avec une. 00:01:23.028 --> 00:01:30.229 Si vous avez encore des questions à propos de ce processus fondamental, il sera bon de revoir 00:01:30.229 --> 00:01:35.499 le programme sur la PCR classique une fois de plus. 00:01:35.499 --> 00:01:41.067 Pour détecter la production de nouvelles amplicons en temps réel, la réaction de PCR nécessite un 00:01:41.067 --> 00:01:50.017 un ingrédient supplémentaire: une sonde d'ADN simple brin, dessinée pour s'hybrider sur la partie de 00:01:50.017 --> 00:01:54.329 la séquence d'ADN synthétisée située entre les deux amorces. 00:01:54.329 --> 00:02:02.529 Cependant, contrairement aux amorces, cette sonde possède des caractéristiques particulières. L'un de ses 00:02:02.529 --> 00:02:11.005 nucléotides est marqué avec une molécule fluorescente pendant qu'un autre nucléotide est marqué 00:02:11.005 --> 00:02:16.004 avec une molécule suppresseur de fluorescence. 00:02:16.004 --> 00:02:23.059 Le suppresseur absorbe rapidement toute l'énergie lumineuse émise par la molécule fluorescente, à condition 00:02:23.059 --> 00:02:27.459 qu'il reste en proximité. 00:02:27.459 --> 00:02:36.159 Passons observer ce qui se passe lorsque cet ingrédient supplémentaire est présent lors d'un 00:02:36.159 --> 00:02:39.769 seul cycle de PCR. 00:02:39.769 --> 00:02:44.099 D'autres amorces s'hybrident aux brins séparés de l'ADN. 00:02:44.099 --> 00:02:49.029 La sonde trouve aussi sa site complémentaire qui se situe entre celles des amorces. 00:02:49.029 --> 00:02:56.629 L'enzyme qui synthétise le nouvel ADN par l'extrémité des amorces possède également une fonction secondaire: 00:02:56.629 --> 00:03:00.719 une activité exonucléase. 00:03:00.719 --> 00:03:07.409 Donc, lorsqu'il rencontre l'ADN double brin dans son chemin, il va le démonter 00:03:07.409 --> 00:03:12.098 et remplacer tous ces nucléotides. 00:03:12.098 --> 00:03:18.379 Quand le polymérase passe à travers la sonde, notez que le nucléotide portant le fluorochrome 00:03:18.379 --> 00:03:24.078 émetteur et l'autre portant le fluorochrome suppresseur ('quencher') sont séparés l'un de l'autre. 00:03:24.078 --> 00:03:32.299 En l'absence d'un suppresseur à proximité, la molécule fluorescente peut alors émettre de la lumière détectable lorsqu'elle est 00:03:32.299 --> 00:03:34.098 stimulée. 00:03:34.098 --> 00:03:41.098 À chaque fois qu'une autre amplicon est produite, un autre marqueur fluorescent est libéré de son fluorochrome 00:03:41.098 --> 00:03:43.017 suppresseur voisin. 00:03:43.017 --> 00:03:50.299 Ainsi, comme le nombre d'amplicons double dans chaque cycle de PCR, la quantité d'énergie 00:03:50.299 --> 00:03:52.959 fluorescent émis double aussi. 00:03:52.959 --> 00:04:00.059 Cette génération de lumière peut être mésurée pendant la réaction dans un thermocycleur PCR équipé 00:04:00.059 --> 00:04:02.012 avec un fluorimètre. 00:04:02.012 --> 00:04:08.689 Donc, si vous commencez avec un échantillon clinique qui n'a qu'une seule copie de l'ADN cible, il faudra 00:04:08.689 --> 00:04:15.048 au moins 40 cycles avant que les amplicons pourront être détectés par un fluorimètre dans un 00:04:15.048 --> 00:04:16.048 thermocycleur spécialisé. 00:04:16.048 --> 00:04:24.006 Par contre, si l'échantillon initial en contient 32 fois copies de plus de l'ADN cible, 00:04:24.006 --> 00:04:30.069 on atteindra le seuil de détection fluorimètrique dans 5 tours de moins de PCR. 00:04:30.069 --> 00:04:38.003 Et s'il y en a 1024 séquences d'ADN cibles de plus dans l'échantillon original, le 00:04:38.003 --> 00:04:42.139 signal fluorescent sera détecté en 10 tours de moins. 00:04:42.139 --> 00:04:48.025 Aussi, la quantité d'ADN spécifique dans l'échantillon clinique est déterminée par référence au 00:04:48.025 --> 00:04:56.819 tour de PCR dans laquelle la quantité de fluorescence atteint le seuil de détection. 00:04:56.819 --> 00:05:04.043 la RT-PCR est la méthode le plus souvent utilisé pour quantifier la charge virale dans le sang des patients 00:05:04.043 --> 00:05:08.449 atteint par le VIH, l'hépatite B, et d'autres virus. 00:05:08.449 --> 00:05:19.289 Mais le VIH est un virus à ARN; il n'a pas d'ADN, et l'ARN dont il est constitué n'est qu'un simple brin. 00:05:19.289 --> 00:05:23.059 Alors, cette méthode peut fonctionner comment? 00:05:23.059 --> 00:05:30.058 La réponse, c'est que l'ARN, originaire d'un virus à ARN, peut être quantifié après être copié 00:05:30.058 --> 00:05:34.005 et converti en l'ADN double brin. 00:05:34.005 --> 00:05:42.389 Cette animation démontre comment cela se passe. D'abord, l'ARN viral est libéré du 00:05:42.389 --> 00:05:43.509 virion. 00:05:43.509 --> 00:05:51.096 Puis, un brin d'ADN complémentaire est synthétisé à partir de l'ARN viral en utilisant la 00:05:51.096 --> 00:05:56.021 transcriptase inverse purifiée, tout comme il le fait dans la réplication naturelle. 00:05:56.021 --> 00:06:06.016 Dans certains procédures, une enzyme RNAse spécialisé est ensuite ajouté pour couper les ARN, ce qui les rendent capable 00:06:06.016 --> 00:06:08.005 d'être dégradés. 00:06:08.005 --> 00:06:15.539 Qu'il fasse partie de la procédure ou non, la prochaine étape importante se produit lorsqu'une ADN polymérase 00:06:15.539 --> 00:06:22.066 et une amorce générent un brin d'ADN complémentaire, tout comme dans la PCR. 00:06:22.066 --> 00:06:31.669 À la fin de cette réaction, on a converti un simple brin d'ARN viral en un double brin 00:06:31.669 --> 00:06:37.024 d'ADN qui a la même séquence de bases nucléotidiques. 00:06:37.024 --> 00:06:42.610 La réaction PCR qualitative peut alors procéder comme décrit précédemment.