1 00:00:02,031 --> 00:00:09,061 (French translation by Samuel Scherber) Ce programme vous démontre comment on peut détecter un acide nucléique spécifique dans un échantillon clinique 2 00:00:09,061 --> 00:00:12,539 et le quantifier en utilisant la PCR. 3 00:00:12,539 --> 00:00:19,949 Ceci est réalisé par la détection de l'accumulation des produits de PCR amplifiés dans le même temps qu'ils sont 4 00:00:19,949 --> 00:00:23,369 générés par la réaction. 5 00:00:23,369 --> 00:00:29,098 Et donc, le processus s'appelle 'en temps réel', ou RT-PCR. 6 00:00:29,098 --> 00:00:38,059 Pour comprendre comment les produits amplifiés par PCR, autrement appellés 'amplicons,' sont détectés en temps réel, 7 00:00:38,059 --> 00:00:46,047 allons voir d'abord les événements qui se déroulent au cours d'un cycle normal de PCR. 8 00:00:46,047 --> 00:00:53,036 Rappelons que la première étape d'un cycle de PCR est d'augmenter la température de réaction et faire deshybrider 9 00:00:53,036 --> 00:00:55,094 l'ADN double brin. 10 00:00:55,094 --> 00:01:03,007 Puis, lorsque la température est suffisamment abaissée, les amorces spécifiques peuvent s'hybrider aux séquences situées à 11 00:01:03,007 --> 00:01:06,084 chaque extrémité de l'ADN cible. 12 00:01:06,084 --> 00:01:15,007 L'ADN intermédiaire peut alors être synthétisé par la réaction de polymérase dans les directions opposées. 13 00:01:15,007 --> 00:01:21,729 En outre, on a obtenu deux copies double brin de l'ADN cible, alors que l'on en a commencé 14 00:01:21,729 --> 00:01:23,028 avec une. 15 00:01:23,028 --> 00:01:30,229 Si vous avez encore des questions à propos de ce processus fondamental, il sera bon de revoir 16 00:01:30,229 --> 00:01:35,499 le programme sur la PCR classique une fois de plus. 17 00:01:35,499 --> 00:01:41,067 Pour détecter la production de nouvelles amplicons en temps réel, la réaction de PCR nécessite un 18 00:01:41,067 --> 00:01:50,017 un ingrédient supplémentaire: une sonde d'ADN simple brin, dessinée pour s'hybrider sur la partie de 19 00:01:50,017 --> 00:01:54,329 la séquence d'ADN synthétisée située entre les deux amorces. 20 00:01:54,329 --> 00:02:02,529 Cependant, contrairement aux amorces, cette sonde possède des caractéristiques particulières. L'un de ses 21 00:02:02,529 --> 00:02:11,005 nucléotides est marqué avec une molécule fluorescente pendant qu'un autre nucléotide est marqué 22 00:02:11,005 --> 00:02:16,004 avec une molécule suppresseur de fluorescence. 23 00:02:16,004 --> 00:02:23,059 Le suppresseur absorbe rapidement toute l'énergie lumineuse émise par la molécule fluorescente, à condition 24 00:02:23,059 --> 00:02:27,459 qu'il reste en proximité. 25 00:02:27,459 --> 00:02:36,159 Passons observer ce qui se passe lorsque cet ingrédient supplémentaire est présent lors d'un 26 00:02:36,159 --> 00:02:39,769 seul cycle de PCR. 27 00:02:39,769 --> 00:02:44,099 D'autres amorces s'hybrident aux brins séparés de l'ADN. 28 00:02:44,099 --> 00:02:49,029 La sonde trouve aussi sa site complémentaire qui se situe entre celles des amorces. 29 00:02:49,029 --> 00:02:56,629 L'enzyme qui synthétise le nouvel ADN par l'extrémité des amorces possède également une fonction secondaire: 30 00:02:56,629 --> 00:03:00,719 une activité exonucléase. 31 00:03:00,719 --> 00:03:07,409 Donc, lorsqu'il rencontre l'ADN double brin dans son chemin, il va le démonter 32 00:03:07,409 --> 00:03:12,098 et remplacer tous ces nucléotides. 33 00:03:12,098 --> 00:03:18,379 Quand le polymérase passe à travers la sonde, notez que le nucléotide portant le fluorochrome 34 00:03:18,379 --> 00:03:24,078 émetteur et l'autre portant le fluorochrome suppresseur ('quencher') sont séparés l'un de l'autre. 35 00:03:24,078 --> 00:03:32,299 En l'absence d'un suppresseur à proximité, la molécule fluorescente peut alors émettre de la lumière détectable lorsqu'elle est 36 00:03:32,299 --> 00:03:34,098 stimulée. 37 00:03:34,098 --> 00:03:41,098 À chaque fois qu'une autre amplicon est produite, un autre marqueur fluorescent est libéré de son fluorochrome 38 00:03:41,098 --> 00:03:43,017 suppresseur voisin. 39 00:03:43,017 --> 00:03:50,299 Ainsi, comme le nombre d'amplicons double dans chaque cycle de PCR, la quantité d'énergie 40 00:03:50,299 --> 00:03:52,959 fluorescent émis double aussi. 41 00:03:52,959 --> 00:04:00,059 Cette génération de lumière peut être mésurée pendant la réaction dans un thermocycleur PCR équipé 42 00:04:00,059 --> 00:04:02,012 avec un fluorimètre. 43 00:04:02,012 --> 00:04:08,689 Donc, si vous commencez avec un échantillon clinique qui n'a qu'une seule copie de l'ADN cible, il faudra 44 00:04:08,689 --> 00:04:15,048 au moins 40 cycles avant que les amplicons pourront être détectés par un fluorimètre dans un 45 00:04:15,048 --> 00:04:16,048 thermocycleur spécialisé. 46 00:04:16,048 --> 00:04:24,006 Par contre, si l'échantillon initial en contient 32 fois copies de plus de l'ADN cible, 47 00:04:24,006 --> 00:04:30,069 on atteindra le seuil de détection fluorimètrique dans 5 tours de moins de PCR. 48 00:04:30,069 --> 00:04:38,003 Et s'il y en a 1024 séquences d'ADN cibles de plus dans l'échantillon original, le 49 00:04:38,003 --> 00:04:42,139 signal fluorescent sera détecté en 10 tours de moins. 50 00:04:42,139 --> 00:04:48,025 Aussi, la quantité d'ADN spécifique dans l'échantillon clinique est déterminée par référence au 51 00:04:48,025 --> 00:04:56,819 tour de PCR dans laquelle la quantité de fluorescence atteint le seuil de détection. 52 00:04:56,819 --> 00:05:04,043 la RT-PCR est la méthode le plus souvent utilisé pour quantifier la charge virale dans le sang des patients 53 00:05:04,043 --> 00:05:08,449 atteint par le VIH, l'hépatite B, et d'autres virus. 54 00:05:08,449 --> 00:05:19,289 Mais le VIH est un virus à ARN; il n'a pas d'ADN, et l'ARN dont il est constitué n'est qu'un simple brin. 55 00:05:19,289 --> 00:05:23,059 Alors, cette méthode peut fonctionner comment? 56 00:05:23,059 --> 00:05:30,058 La réponse, c'est que l'ARN, originaire d'un virus à ARN, peut être quantifié après être copié 57 00:05:30,058 --> 00:05:34,005 et converti en l'ADN double brin. 58 00:05:34,005 --> 00:05:42,389 Cette animation démontre comment cela se passe. D'abord, l'ARN viral est libéré du 59 00:05:42,389 --> 00:05:43,509 virion. 60 00:05:43,509 --> 00:05:51,096 Puis, un brin d'ADN complémentaire est synthétisé à partir de l'ARN viral en utilisant la 61 00:05:51,096 --> 00:05:56,021 transcriptase inverse purifiée, tout comme il le fait dans la réplication naturelle. 62 00:05:56,021 --> 00:06:06,016 Dans certains procédures, une enzyme RNAse spécialisé est ensuite ajouté pour couper les ARN, ce qui les rendent capable 63 00:06:06,016 --> 00:06:08,005 d'être dégradés. 64 00:06:08,005 --> 00:06:15,539 Qu'il fasse partie de la procédure ou non, la prochaine étape importante se produit lorsqu'une ADN polymérase 65 00:06:15,539 --> 00:06:22,066 et une amorce générent un brin d'ADN complémentaire, tout comme dans la PCR. 66 00:06:22,066 --> 00:06:31,669 À la fin de cette réaction, on a converti un simple brin d'ARN viral en un double brin 67 00:06:31,669 --> 00:06:37,024 d'ADN qui a la même séquence de bases nucléotidiques. 68 00:06:37,024 --> 00:06:42,610 La réaction PCR qualitative peut alors procéder comme décrit précédemment.