(French translation by Samuel Scherber) Ce programme vous démontre comment on peut détecter un acide nucléique spécifique dans un échantillon clinique
et le quantifier en utilisant la PCR.
Ceci est réalisé par la détection de l'accumulation des produits de PCR amplifiés dans le même temps qu'ils sont
générés par la réaction.
Et donc, le processus s'appelle 'en temps réel', ou RT-PCR.
Pour comprendre comment les produits amplifiés par PCR, autrement appellés 'amplicons,' sont détectés en temps réel,
allons voir d'abord les événements qui se déroulent au cours d'un cycle normal de PCR.
Rappelons que la première étape d'un cycle de PCR est d'augmenter la température de réaction et faire deshybrider
l'ADN double brin.
Puis, lorsque la température est suffisamment abaissée, les amorces spécifiques peuvent s'hybrider aux séquences situées à
chaque extrémité de l'ADN cible.
L'ADN intermédiaire peut alors être synthétisé par la réaction de polymérase dans les directions opposées.
En outre, on a obtenu deux copies double brin de l'ADN cible, alors que l'on en a commencé
avec une.
Si vous avez encore des questions à propos de ce processus fondamental, il sera bon de revoir
le programme sur la PCR classique une fois de plus.
Pour détecter la production de nouvelles amplicons en temps réel, la réaction de PCR nécessite un
un ingrédient supplémentaire: une sonde d'ADN simple brin, dessinée pour s'hybrider sur la partie de
la séquence d'ADN synthétisée située entre les deux amorces.
Cependant, contrairement aux amorces, cette sonde possède des caractéristiques particulières. L'un de ses
nucléotides est marqué avec une molécule fluorescente pendant qu'un autre nucléotide est marqué
avec une molécule suppresseur de fluorescence.
Le suppresseur absorbe rapidement toute l'énergie lumineuse émise par la molécule fluorescente, à condition
qu'il reste en proximité.
Passons observer ce qui se passe lorsque cet ingrédient supplémentaire est présent lors d'un
seul cycle de PCR.
D'autres amorces s'hybrident aux brins séparés de l'ADN.
La sonde trouve aussi sa site complémentaire qui se situe entre celles des amorces.
L'enzyme qui synthétise le nouvel ADN par l'extrémité des amorces possède également une fonction secondaire:
une activité exonucléase.
Donc, lorsqu'il rencontre l'ADN double brin dans son chemin, il va le démonter
et remplacer tous ces nucléotides.
Quand le polymérase passe à travers la sonde, notez que le nucléotide portant le fluorochrome
émetteur et l'autre portant le fluorochrome suppresseur ('quencher') sont séparés l'un de l'autre.
En l'absence d'un suppresseur à proximité, la molécule fluorescente peut alors émettre de la lumière détectable lorsqu'elle est
stimulée.
À chaque fois qu'une autre amplicon est produite, un autre marqueur fluorescent est libéré de son fluorochrome
suppresseur voisin.
Ainsi, comme le nombre d'amplicons double dans chaque cycle de PCR, la quantité d'énergie
fluorescent émis double aussi.
Cette génération de lumière peut être mésurée pendant la réaction dans un thermocycleur PCR équipé
avec un fluorimètre.
Donc, si vous commencez avec un échantillon clinique qui n'a qu'une seule copie de l'ADN cible, il faudra
au moins 40 cycles avant que les amplicons pourront être détectés par un fluorimètre dans un
thermocycleur spécialisé.
Par contre, si l'échantillon initial en contient 32 fois copies de plus de l'ADN cible,
on atteindra le seuil de détection fluorimètrique dans 5 tours de moins de PCR.
Et s'il y en a 1024 séquences d'ADN cibles de plus dans l'échantillon original, le
signal fluorescent sera détecté en 10 tours de moins.
Aussi, la quantité d'ADN spécifique dans l'échantillon clinique est déterminée par référence au
tour de PCR dans laquelle la quantité de fluorescence atteint le seuil de détection.
la RT-PCR est la méthode le plus souvent utilisé pour quantifier la charge virale dans le sang des patients
atteint par le VIH, l'hépatite B, et d'autres virus.
Mais le VIH est un virus à ARN; il n'a pas d'ADN, et l'ARN dont il est constitué n'est qu'un simple brin.
Alors, cette méthode peut fonctionner comment?
La réponse, c'est que l'ARN, originaire d'un virus à ARN, peut être quantifié après être copié
et converti en l'ADN double brin.
Cette animation démontre comment cela se passe. D'abord, l'ARN viral est libéré du
virion.
Puis, un brin d'ADN complémentaire est synthétisé à partir de l'ARN viral en utilisant la
transcriptase inverse purifiée, tout comme il le fait dans la réplication naturelle.
Dans certains procédures, une enzyme RNAse spécialisé est ensuite ajouté pour couper les ARN, ce qui les rendent capable
d'être dégradés.
Qu'il fasse partie de la procédure ou non, la prochaine étape importante se produit lorsqu'une ADN polymérase
et une amorce générent un brin d'ADN complémentaire, tout comme dans la PCR.
À la fin de cette réaction, on a converti un simple brin d'ARN viral en un double brin
d'ADN qui a la même séquence de bases nucléotidiques.
La réaction PCR qualitative peut alors procéder comme décrit précédemment.