WEBVTT

00:00:00.000 --> 00:00:02.840
researchlabs@ واحد آموزشی شرکت طب یاران سیلک یاخته

00:00:02.840 --> 00:00:05.860
این ویدیو نشان می دهد که چگونه می توان با استفاده از

00:00:05.860 --> 00:00:09.330
PCR یک نوکلئیک اسید خاص را در نمونه های بالینی

00:00:09.330 --> 00:00:12.720
شناسایی کردو مفدار ان را سنجید

00:00:13.326 --> 00:00:23.236
این موضوع با شناسایی محصول PCR تکثیر شده انجام می شود

00:00:23.656 --> 00:00:31.186
این فرایند Real time PCRیا RT PCR نامیده می شود

00:00:31.249 --> 00:00:39.659
برای اینکه بفهمیم محصولات PCR چگونه شناسایی می شوند،

00:00:39.659 --> 00:00:45.779
در ابتدا باید اتفاقاتی که در یک سیکل PCR می افتد را بررسی کنیم.

00:00:46.492 --> 00:00:52.542
اولین مرحله در PCR، افزایش دمای واکنش

00:00:52.542 --> 00:00:56.182
و ذوب کردن dna دورشته ای می باشد.

00:00:56.182 --> 00:00:59.012
سپس وقتی که دما پایین امد،

00:00:59.012 --> 00:01:06.412
پرایمرهای اختصاصی به توالی های انتهایی dna می چسبند.

00:01:06.919 --> 00:01:12.739
حالا DNA جدید می تواند با فعالیت آنزیم پلیمراز

00:01:12.739 --> 00:01:16.079
در جهت های مخالف ساخته شود.

00:01:16.079 --> 00:01:20.999
در نتیجه دو کپی از DNA اولیه وجود خواهد داشت.

00:01:24.554 --> 00:01:28.034
اگر این فرایند را متوجه نشدید

00:01:28.034 --> 00:01:34.314
، ویدیوهای مربوط به PCRساده را یکبار دیگر مرور کنید.

00:01:35.788 --> 00:01:39.748
برای شناسایی تولید محصولات جدید در RT PCR،

00:01:39.748 --> 00:01:43.388
واکنش PCR نیاز به مواد دیگری نیز دارد:

00:01:44.244 --> 00:01:47.514
یک پروب DNAتک رشته ای.

00:01:47.514 --> 00:01:52.189
این پروب برای جفت شدن با بخشی از DNA طراحی شده است

00:01:52.189 --> 00:01:55.354
که در بین دو پرایمر سنتز می شود.

00:01:55.421 --> 00:01:59.176
به هرحال بر خلاف پرایمرها، این پروب با روش های اختصاصی

00:01:59.176 --> 00:02:02.081
شناسایی می شود.و حساسیت شناسایی را بالا می برد

00:02:02.081 --> 00:02:08.821
یکی از این نوکلئوتیدها با یک مولکول فلورسنت

00:02:08.821 --> 00:02:16.541
و دیگری با مولکول QUENCHER یا خاموش کننده لیبل می شود.

00:02:16.636 --> 00:02:20.786
مولکول خاموش کننده، به سرعت انرژی نورهای متساعدشده از

00:02:20.786 --> 00:02:23.136
فلورسنت را جذب می کند.

00:02:23.136 --> 00:02:26.706
البته تا زمانی که در فاصله نزدیکی از یکدیگر باقی بمانند.

00:02:30.385 --> 00:02:38.465
حالا بیایید ببینیم وقتی این مواد در واکنش حضور دارند، چه اتفاقی می افتد.

00:02:40.039 --> 00:02:44.039
پرایمرها به رشته های DNA جدا شده، می چسبد.

00:02:44.039 --> 00:02:48.039
پروب هم به جایگاه مکمل بین پرایمرها متصل می شود.

00:02:49.576 --> 00:02:54.966
انزیم، از دو انتهای پرایمرها، DNA جدید را می سازد.

00:02:54.966 --> 00:02:59.926
هم چنین این انزیم یک فعالیت خارج هسته ای دیگر هم دارد:

00:03:00.904 --> 00:03:04.904
این انزیم وقتی در مسیر خود به DNAدو رشته ای می رسد،

00:03:04.977 --> 00:03:08.217
تمامی نوکلئوتیدهای DNA را جدا کرده

00:03:08.217 --> 00:03:11.997
و ان ها دوباره جایگزین می کند.

00:03:12.930 --> 00:03:16.220
زمانی که پلیمراز، از پروب عبور می کند،

00:03:16.220 --> 00:03:24.690
نوکلئوتید دارای مارکر فلورسنت و خاموش کننده را از هم جدا می کند.

00:03:24.690 --> 00:03:31.390
وقتی این دو مارکر جدا شدند، مولکول فلورسنت در صورت تحریک

00:03:31.390 --> 00:03:34.738
میتواند نور قابل تشخیصی را تولید کند.

00:03:34.738 --> 00:03:38.363
هر بار که رشته جدید از DNA ساخته می شود،

00:03:38.363 --> 00:03:42.938
یک مولکول فلورسنت از خاموش کننده خود جدا می ماند.

00:03:43.060 --> 00:03:48.860
بنابراین با دوبرابر شدن مقدار DNA در هر سیکل PCR،

00:03:48.860 --> 00:03:53.760
مقدار انرژی تولیدی توسط فلورسنت نیز بالا می رود.

00:03:53.824 --> 00:04:02.154
این انرژی زیاد توسط یک فلورمتر در داخل 
دستگاه ترموسایکلر اندازه گیری می شود.

00:04:02.716 --> 00:04:09.286
بنابراین اگر شما فرایند را با نمونه بالینی دارای یک کپی از DNA اغاز کنید،

00:04:09.342 --> 00:04:12.782
به اندازه 40 سیکل PCR زمان می برد

00:04:12.782 --> 00:04:16.862
تا این انرژی از طریق فلورمتر دستگاه، شناسایی شود.

00:04:17.227 --> 00:04:24.372
اگر نمونه شما دارای بیش از 32 کپی از DNA باشد،

00:04:24.372 --> 00:04:30.617
فرایند شناسایی در طی 5 سیکل کمتر اتفاق می افتد.

00:04:31.621 --> 00:04:36.921
و اگر 1024 برابر بیشتر از نمونه خود را داشته باشید،

00:04:36.921 --> 00:04:42.461
فلورسنت در طی 10 سیکل کمتر شناسایی خواهد شد.

00:04:43.168 --> 00:04:50.493
بنابراین مقدار DNA موجود در نمونه،
با توجه به تعداد سیکل های PCR شناسایی خواهد شد.

00:04:50.493 --> 00:04:57.063
زیرا مقدار فلورسنت نمونه به پایین ترین حد استانه تشخیص رسبده است

00:04:57.063 --> 00:05:05.548
RT PCR معمولا برای شناسایی مقدار ویروس در خون بیماران HIV ،

00:05:05.548 --> 00:05:10.483
هپاتیت B و دیگر ویروس ها به کار می رود

00:05:10.483 --> 00:05:15.363
اما HIV یک ویروس دارای RNA است و DNA ندارد.

00:05:15.372 --> 00:05:18.932
RNAتک رشته ای است.

00:05:18.932 --> 00:05:24.072
بنابراین این فرایند چگونه انجام می شود؟

00:05:24.213 --> 00:05:28.293
پاسخ این است: RNA بعد از کپی شدن

00:05:28.293 --> 00:05:33.883
یا تبدیل شدن به DNA دو رشته ای اندازه گیری می شود.

00:05:33.901 --> 00:05:37.901
این انیمیشن چگونگی این موضوع را نشان می دهد.

00:05:39.173 --> 00:05:44.158
در ابتدا RNA ویروسی از ویروس ازاد میشود

00:05:44.158 --> 00:05:53.963
سپس با استفاده از انزیم ریورس ترنس کریپتاز، از RNA ویروسی یک DNA مکمل ساخته می شود.

00:05:55.343 --> 00:05:56.343
مشابه عمل ترجمه ی طبیعی که اتفاق می افتد

00:05:57.724 --> 00:06:02.839
در بعضی از پروتوکل ها یک انزیم RNase اختصاصی هم اضافه می شود

00:06:02.839 --> 00:06:07.034
تا RNA را بسازد و به ان اجازه می دهد تا تجزیه شود.

00:06:08.601 --> 00:06:14.056
جدا از اینکه این مرحله اتفاق بیوفتد یا نه، مرحله کلیدی بعدی این است

00:06:14.056 --> 00:06:23.531
که مشابه با واکنش PCR، DNAپلیمراز و پرایمر یک رشته DNA مکمل را می سازد.

00:06:23.541 --> 00:06:30.376
در انتهای واکنش، RNA تک رشته ای ویروسی

00:06:30.376 --> 00:06:37.212
به DNA دور شته ای تبدیل شده که همان نوکلئوتیدها را دارد.

00:06:37.318 --> 00:06:43.321
حالا فرایند PCR می تواند برای این ,DNA همانند قبل انجام شود.

00:06:43.321 --> 00:06:43.571
researchlabs@ مرجع دانلود ویدئو های آموزشی