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Dialogue: 0,0:00:02.03,0:00:09.06,Default,,0000,0000,0000,,(Spanish/Español translation by Dr. Gabriela Gorelik, University of Michigan and Juan Rodrigo Martin de Lucia)\NEste video muestra como un ácido nucleico específico se puede detectar y cuantificar en una muestra clínica
Dialogue: 0,0:00:09.06,0:00:12.54,Default,,0000,0000,0000,,usando PCR.
Dialogue: 0,0:00:12.54,0:00:19.95,Default,,0000,0000,0000,,Esto se logra mediante la detección de la acumulación de los productos amplificados por PCR, a medida que son
Dialogue: 0,0:00:19.95,0:00:23.37,Default,,0000,0000,0000,,generados en la reacción.
Dialogue: 0,0:00:23.37,0:00:29.10,Default,,0000,0000,0000,,Y así, el proceso se llama PCR en tiempo real o RT-PCR.
Dialogue: 0,0:00:29.10,0:00:38.06,Default,,0000,0000,0000,,Para entender cómo los productos amplificados por PCR, también conocidos como amplicones, se detectan en tiempo real,
Dialogue: 0,0:00:38.06,0:00:46.05,Default,,0000,0000,0000,,primero vamos a repasar los eventos que se producen durante un ciclo normal de la reacción de PCR.
Dialogue: 0,0:00:46.05,0:00:53.04,Default,,0000,0000,0000,,Recordemos que el primer paso en cualquier ciclo de PCR es elevar la temperatura de reacción y fundir el
Dialogue: 0,0:00:53.04,0:00:55.09,Default,,0000,0000,0000,,ADN de doble cadena.
Dialogue: 0,0:00:55.09,0:01:03.01,Default,,0000,0000,0000,,Así, cuando la temperatura baja, los primers específicos se unen a las secuencias en
Dialogue: 0,0:01:03.01,0:01:06.08,Default,,0000,0000,0000,,cada extremo del ADN en cuestión.
Dialogue: 0,0:01:06.08,0:01:15.01,Default,,0000,0000,0000,,El ADN entonces se sintetiza por la reacción de la polimerasa en direcciones opuestas.
Dialogue: 0,0:01:15.01,0:01:21.73,Default,,0000,0000,0000,,Así se producen dos copias del ADN de doble cadena , cuando se había empezado
Dialogue: 0,0:01:21.73,0:01:23.03,Default,,0000,0000,0000,,con sólo una.
Dialogue: 0,0:01:23.03,0:01:30.23,Default,,0000,0000,0000,,Si no le ha quedado claro este proceso básico, sería una buena idea revisar
Dialogue: 0,0:01:30.23,0:01:35.50,Default,,0000,0000,0000,,el fundamento de PCR una vez más.
Dialogue: 0,0:01:35.50,0:01:41.07,Default,,0000,0000,0000,,Para detectar la generación de amplicones nuevos en tiempo real, la reacción de PCR requiere un
Dialogue: 0,0:01:41.07,0:01:50.02,Default,,0000,0000,0000,,ingrediente adicional: una sonda de ADN de simple cadena, diseñada para hibridizar
Dialogue: 0,0:01:50.02,0:01:54.33,Default,,0000,0000,0000,,la secuencia de ADN sintetizada entre los dos primers.
Dialogue: 0,0:01:54.33,0:02:02.53,Default,,0000,0000,0000,,Sin embargo, a diferencia de los primers, esta sonda es más definida en una manera especial. Uno de sus
Dialogue: 0,0:02:02.53,0:02:11.00,Default,,0000,0000,0000,,nucleótidos está marcado covalentemente con una molécula fluorescente y otro nucleótido es marcado
Dialogue: 0,0:02:11.00,0:02:16.00,Default,,0000,0000,0000,,con una molécula extinguidora de la fluorescencia.
Dialogue: 0,0:02:16.00,0:02:23.06,Default,,0000,0000,0000,,La molécula extinguidora rápidamente absorbe energía de la luz emitida por la molécula fluorescente, siempre
Dialogue: 0,0:02:23.06,0:02:27.46,Default,,0000,0000,0000,,y cuando se mantenga en estrecha proximidad.
Dialogue: 0,0:02:27.46,0:02:36.16,Default,,0000,0000,0000,,Ahora, veamos lo que ocurre cuando este ingrediente adicional está presente durante un
Dialogue: 0,0:02:36.16,0:02:39.77,Default,,0000,0000,0000,,único ciclo de PCR.
Dialogue: 0,0:02:39.77,0:02:44.10,Default,,0000,0000,0000,,Otros primers se unen a las cadenas separadas de ADN.
Dialogue: 0,0:02:44.10,0:02:49.03,Default,,0000,0000,0000,,La sonda también encuentra sus sitios complementarios entre ellos.
Dialogue: 0,0:02:49.03,0:02:56.63,Default,,0000,0000,0000,,La enzima que sintetiza ADN nuevo a partir de los extremos de los primers también tiene una segunda actividad:
Dialogue: 0,0:02:56.63,0:03:00.72,Default,,0000,0000,0000,,una actividad exonuclear.
Dialogue: 0,0:03:00.72,0:03:07.41,Default,,0000,0000,0000,,Así, cuando se encuentra con ADN de doble cadena, desensambla la cadena
Dialogue: 0,0:03:07.41,0:03:12.10,Default,,0000,0000,0000,,y sustituye todos los nucleótidos.
Dialogue: 0,0:03:12.10,0:03:18.38,Default,,0000,0000,0000,,A medida que la polimerasa pasa a través de la sonda, los nucleótidos que llevan la marca fluorescente
Dialogue: 0,0:03:18.38,0:03:24.08,Default,,0000,0000,0000,,se separan del extinguidor.
Dialogue: 0,0:03:24.08,0:03:32.30,Default,,0000,0000,0000,,En ausencia de un extinguidor cercano, la molécula fluorescente puede emitir luz detectable cuando
Dialogue: 0,0:03:32.30,0:03:34.10,Default,,0000,0000,0000,,es estimulada.
Dialogue: 0,0:03:34.10,0:03:41.10,Default,,0000,0000,0000,,Cada vez que se produce otro amplicón, otro marcador fluorescente se libera de su vecino
Dialogue: 0,0:03:41.10,0:03:43.02,Default,,0000,0000,0000,,extinguidor.
Dialogue: 0,0:03:43.02,0:03:50.30,Default,,0000,0000,0000,,Por tanto, como el número de amplicones se duplica en cada ciclo de PCR, la cantidad emitida
Dialogue: 0,0:03:50.30,0:03:52.96,Default,,0000,0000,0000,,de energía fluorescente también se duplica.
Dialogue: 0,0:03:52.96,0:04:00.06,Default,,0000,0000,0000,,Esta generación de luz se puede monitorear durante la reacción de PCR con el fluorómetro que posee el termociclador.
Dialogue: 0,0:04:00.06,0:04:02.01,Default,,0000,0000,0000,,
Dialogue: 0,0:04:02.01,0:04:08.69,Default,,0000,0000,0000,,Así, si se empieza con una muestra clínica que tenía sólo una copia del ADN, podría
Dialogue: 0,0:04:08.69,0:04:15.05,Default,,0000,0000,0000,,tomar 40 ciclos o más antes de que los amplicones se detecten mediante un fluorómetro en un
Dialogue: 0,0:04:15.05,0:04:16.05,Default,,0000,0000,0000,,termociclador especializado.
Dialogue: 0,0:04:16.05,0:04:24.01,Default,,0000,0000,0000,,Sin embargo, si la muestra original contenía 32 veces más copias del ADN en cuestión, entonces
Dialogue: 0,0:04:24.01,0:04:30.07,Default,,0000,0000,0000,,la detección fluorimétrica ocurriría en 5 ciclos menos de PCR.
Dialogue: 0,0:04:30.07,0:04:38.00,Default,,0000,0000,0000,,Y si hubiera en la muestra original 1.024 secuencias más del ADN en cuestión, entonces la señal fluorescente
Dialogue: 0,0:04:38.00,0:04:42.14,Default,,0000,0000,0000,,sería detectada 10 ciclos antes.
Dialogue: 0,0:04:42.14,0:04:48.02,Default,,0000,0000,0000,,Así, la cantidad de ADN en cuestión en la muestra clínica es determinada en referencia al
Dialogue: 0,0:04:48.02,0:04:56.82,Default,,0000,0000,0000,,ciclo de PCR en la que la curva de fluorescencia cruza el umbral de detección.
Dialogue: 0,0:04:56.82,0:05:04.04,Default,,0000,0000,0000,,RT-PCR es muy comúnmente utilizado para cuantificar la carga viral en la sangre de pacientes
Dialogue: 0,0:05:04.04,0:05:08.45,Default,,0000,0000,0000,,con el HIV, hepatitis B y otros virus.
Dialogue: 0,0:05:08.45,0:05:19.29,Default,,0000,0000,0000,,Pero el VIH es un virus de ARN, no tiene ADN, y el ARN que posee es monocatenario.
Dialogue: 0,0:05:19.29,0:05:23.06,Default,,0000,0000,0000,,Entonces, como funciona este método?
Dialogue: 0,0:05:23.06,0:05:30.06,Default,,0000,0000,0000,,La respuesta es que el ARN del virus de ARN, se puede cuantificar después de que haya sido copiado
Dialogue: 0,0:05:30.06,0:05:34.00,Default,,0000,0000,0000,,y convertido en ADN de doble cadena.
Dialogue: 0,0:05:34.00,0:05:42.39,Default,,0000,0000,0000,,Este video muestra cómo se logra esto. En primer lugar, el ARN viral se libera del
Dialogue: 0,0:05:42.39,0:05:43.51,Default,,0000,0000,0000,,virión.
Dialogue: 0,0:05:43.51,0:05:51.10,Default,,0000,0000,0000,,Entonces, una cadena de ADN complementario se sintetiza a partir del ARN viral usando transcriptasa reversa purificada,
Dialogue: 0,0:05:51.10,0:05:56.02,Default,,0000,0000,0000,,tal como lo hace en la replicación natural.
Dialogue: 0,0:05:56.02,0:06:06.02,Default,,0000,0000,0000,,En algunos protocolos, una enzyma ARNasa especializada se agrega para formar el ARN y permitir
Dialogue: 0,0:06:06.02,0:06:08.00,Default,,0000,0000,0000,,ser degradadas.
Dialogue: 0,0:06:08.00,0:06:15.54,Default,,0000,0000,0000,,Si es o no parte del procedimiento, el siguiente paso clave se produce cuando una ADN polimerasa
Dialogue: 0,0:06:15.54,0:06:22.07,Default,,0000,0000,0000,,y un primer generan una cadena de ADN complementario, tal como en la reacción de PCR.
Dialogue: 0,0:06:22.07,0:06:31.67,Default,,0000,0000,0000,,Al final de esta reacción, el ARN viral de una sola cadena se ha convertido DNA de doble cadena
Dialogue: 0,0:06:31.67,0:06:37.02,Default,,0000,0000,0000,,que tiene la misma secuencia de bases de nucleótidos.
Dialogue: 0,0:06:37.02,0:06:42.61,Default,,0000,0000,0000,,La reacción de PCR cualitativa puede proceder como se describió previamente.