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(Spanish/Español translation by Dr. Gabriela Gorelik, University of Michigan and Juan Rodrigo Martin de Lucia)[br]Este video muestra como un ácido nucleico específico se puede detectar y cuantificar en una muestra clínica

0:00:09.061,0:00:12.539
usando PCR.

0:00:12.539,0:00:19.949
Esto se logra mediante la detección de la acumulación de los productos amplificados por PCR, a medida que son

0:00:19.949,0:00:23.369
generados en la reacción.

0:00:23.369,0:00:29.098
Y así, el proceso se llama PCR en tiempo real o RT-PCR.

0:00:29.098,0:00:38.059
Para entender cómo los productos amplificados por PCR, también conocidos como amplicones, se detectan en tiempo real,

0:00:38.059,0:00:46.047
primero vamos a repasar los eventos que se producen durante un ciclo normal de la reacción de PCR.

0:00:46.047,0:00:53.036
Recordemos que el primer paso en cualquier ciclo de PCR es elevar la temperatura de reacción y fundir el

0:00:53.036,0:00:55.094
ADN de doble cadena.

0:00:55.094,0:01:03.007
Así, cuando la temperatura baja, los primers específicos se unen a las secuencias en

0:01:03.007,0:01:06.084
cada extremo del ADN en cuestión.

0:01:06.084,0:01:15.007
El ADN entonces se sintetiza por la reacción de la polimerasa en direcciones opuestas.

0:01:15.007,0:01:21.729
Así se producen dos copias del ADN de doble cadena , cuando se había empezado

0:01:21.729,0:01:23.028
con sólo una.

0:01:23.028,0:01:30.229
Si no le ha quedado claro este proceso básico, sería una buena idea revisar

0:01:30.229,0:01:35.499
el fundamento de PCR una vez más.

0:01:35.499,0:01:41.067
Para detectar la generación de amplicones nuevos en tiempo real, la reacción de PCR requiere un

0:01:41.067,0:01:50.017
ingrediente adicional: una sonda de ADN de simple cadena, diseñada para hibridizar

0:01:50.017,0:01:54.329
la secuencia de ADN sintetizada entre los dos primers.

0:01:54.329,0:02:02.529
Sin embargo, a diferencia de los primers, esta sonda es más definida en una manera especial. Uno de sus

0:02:02.529,0:02:11.005
nucleótidos está marcado covalentemente con una molécula fluorescente y otro nucleótido es marcado

0:02:11.005,0:02:16.004
con una molécula extinguidora de la fluorescencia.

0:02:16.004,0:02:23.059
La molécula extinguidora rápidamente absorbe energía de la luz emitida por la molécula fluorescente, siempre

0:02:23.059,0:02:27.459
y cuando se mantenga en estrecha proximidad.

0:02:27.459,0:02:36.159
Ahora, veamos lo que ocurre cuando este ingrediente adicional está presente durante un

0:02:36.159,0:02:39.769
único ciclo de PCR.

0:02:39.769,0:02:44.099
Otros primers se unen a las cadenas separadas de ADN.

0:02:44.099,0:02:49.029
La sonda también encuentra sus sitios complementarios entre ellos.

0:02:49.029,0:02:56.629
La enzima que sintetiza ADN nuevo a partir de los extremos de los primers también tiene una segunda actividad:

0:02:56.629,0:03:00.719
una actividad exonuclear.

0:03:00.719,0:03:07.409
Así, cuando se encuentra con ADN de doble cadena, desensambla la cadena

0:03:07.409,0:03:12.098
y sustituye todos los nucleótidos.

0:03:12.098,0:03:18.379
A medida que la polimerasa pasa a través de la sonda, los nucleótidos que llevan la marca fluorescente

0:03:18.379,0:03:24.078
se separan del extinguidor.

0:03:24.078,0:03:32.299
En ausencia de un extinguidor cercano, la molécula fluorescente puede emitir luz detectable cuando

0:03:32.299,0:03:34.098
es estimulada.

0:03:34.098,0:03:41.098
Cada vez que se produce otro amplicón, otro marcador fluorescente se libera de su vecino

0:03:41.098,0:03:43.017
extinguidor.

0:03:43.017,0:03:50.299
Por tanto, como el número de amplicones se duplica en cada ciclo de PCR, la cantidad emitida

0:03:50.299,0:03:52.959
de energía fluorescente también se duplica.

0:03:52.959,0:04:00.059
Esta generación de luz se puede monitorear durante la reacción de PCR con el fluorómetro que posee el termociclador.

0:04:00.059,0:04:02.012


0:04:02.012,0:04:08.689
Así, si se empieza con una muestra clínica que tenía sólo una copia del ADN, podría

0:04:08.689,0:04:15.048
tomar 40 ciclos o más antes de que los amplicones se detecten mediante un fluorómetro en un

0:04:15.048,0:04:16.048
termociclador especializado.

0:04:16.048,0:04:24.006
Sin embargo, si la muestra original contenía 32 veces más copias del ADN en cuestión, entonces

0:04:24.006,0:04:30.069
la detección fluorimétrica ocurriría en 5 ciclos menos de PCR.

0:04:30.069,0:04:38.003
Y si hubiera en la muestra original 1.024 secuencias más del ADN en cuestión, entonces la señal fluorescente

0:04:38.003,0:04:42.139
sería detectada 10 ciclos antes.

0:04:42.139,0:04:48.025
Así, la cantidad de ADN en cuestión en la muestra clínica es determinada en referencia al

0:04:48.025,0:04:56.819
ciclo de PCR en la que la curva de fluorescencia cruza el umbral de detección.

0:04:56.819,0:05:04.043
RT-PCR es muy comúnmente utilizado para cuantificar la carga viral en la sangre de pacientes

0:05:04.043,0:05:08.449
con el HIV, hepatitis B y otros virus.

0:05:08.449,0:05:19.289
Pero el VIH es un virus de ARN, no tiene ADN, y el ARN que posee es monocatenario.

0:05:19.289,0:05:23.059
Entonces, como funciona este método?

0:05:23.059,0:05:30.058
La respuesta es que el ARN del virus de ARN, se puede cuantificar después de que haya sido copiado

0:05:30.058,0:05:34.005
y convertido en ADN de doble cadena.

0:05:34.005,0:05:42.389
Este video muestra cómo se logra esto. En primer lugar, el ARN viral se libera del

0:05:42.389,0:05:43.509
virión.

0:05:43.509,0:05:51.096
Entonces, una cadena de ADN complementario se sintetiza a partir del ARN viral usando transcriptasa reversa purificada,

0:05:51.096,0:05:56.021
tal como lo hace en la replicación natural.

0:05:56.021,0:06:06.016
En algunos protocolos, una enzyma ARNasa especializada se agrega para formar el ARN y permitir

0:06:06.016,0:06:08.005
ser degradadas.

0:06:08.005,0:06:15.539
Si es o no parte del procedimiento, el siguiente paso clave se produce cuando una ADN polimerasa

0:06:15.539,0:06:22.066
y un primer generan una cadena de ADN complementario, tal como en la reacción de PCR.

0:06:22.066,0:06:31.669
Al final de esta reacción, el ARN viral de una sola cadena se ha convertido DNA de doble cadena

0:06:31.669,0:06:37.024
que tiene la misma secuencia de bases de nucleótidos.

0:06:37.024,0:06:42.610
La reacción de PCR cualitativa puede proceder como se describió previamente.