WEBVTT 00:00:02.031 --> 00:00:09.061 (Danish translation by Beatrix M. G. Nielsen, University of Copenhagen) Dette program viser, hvordan en specifik nukleinsyresekvens i en klinisk prøve kan spores 00:00:09.061 --> 00:00:12.539 og kvantificeres ved anvendelse af PCR (Polymerase Chain Reaktion, på dansk polymerasekædereaktion). 00:00:12.539 --> 00:00:19.949 Dette opnås ved at registrere akkumuleringen af de amplificerede PCR-produkter, som de bliver 00:00:19.949 --> 00:00:23.369 dannet i reaktionen. 00:00:23.369 --> 00:00:29.098 Derfor kaldes processen RealTid (Real-Time), eller RTPCR. 00:00:29.098 --> 00:00:38.059 For at forstå hvordan amplificerede PCR-produkter, også kaldet amplikoner, spores i realtid, 00:00:38.059 --> 00:00:46.047 så lad os først betragte de hændelser, som forekommer ved en normal cyklus af PCR-reaktionen. 00:00:46.047 --> 00:00:53.036 Husk, at det første trin i en PCR-cyklus er at øge reaktionstemperaturen og derved smelte 00:00:53.036 --> 00:00:55.094 dobbeltstrenget DNA. 00:00:55.094 --> 00:01:03.007 Så, når temperaturen sænkes, binder de specifikke primere til sekvenserne i 00:01:03.007 --> 00:01:06.084 hver ende af mål-DNA'et. 00:01:06.084 --> 00:01:15.007 Det mellemliggende DNA kan derefter syntetiseres ved polymerasereaktion i modsatte retninger. 00:01:15.007 --> 00:01:21.729 Som resultat producerer du to dobbelt-strengede kopier af mål-DNA'et, hvor du til at begyndte med 00:01:21.729 --> 00:01:23.028 kun havde én. 00:01:23.028 --> 00:01:30.229 Hvis en del af denne grundlæggende proces fovirrer dig, kan det være en god ide at gennemgå 00:01:30.229 --> 00:01:35.499 programmet om grundlæggende PCR igen. 00:01:35.499 --> 00:01:41.067 For at spore dannelsen af nye amplikoner i realtid, har PCR-reaktionen brug for 00:01:41.067 --> 00:01:50.017 noget yderligere - en enkeltstrenget DNA-probe, designet til at binde sig til en del af den 00:01:50.017 --> 00:01:54.329 DNA-sekvens, der bliver syntetiseret mellem de to primere. 00:01:54.329 --> 00:02:02.529 Men i modsætning til primerene, er denne probe mærket mere specifikt. En af dens 00:02:02.529 --> 00:02:11.005 nukleotider er mærket med et fluorescerende molekyle og et andet nucleotid er mærket 00:02:11.005 --> 00:02:16.004 med et fluorescerende quencher-molekyle. (to quench betyder "at slukke") 00:02:16.004 --> 00:02:23.059 Quencheren absorberer hurtigt al lysenergi, der udsendes af det fluorescerende molekyle, så længe 00:02:23.059 --> 00:02:27.459 molekylet forbliver meget tæt på quencheren. 00:02:27.459 --> 00:02:36.159 Lad os nu se, hvad der sker, når denne ekstra ingrediens er tilstede under en 00:02:36.159 --> 00:02:39.769 enkelt cyklus af PCR. 00:02:39.769 --> 00:02:44.099 Andre primere binder til de separate strenge af DNA. 00:02:44.099 --> 00:02:49.029 Proben finder også sin komplimentære sekvens imellem dem. 00:02:49.029 --> 00:02:56.629 Enzymet syntetiserer nyt DNA fra enderne af primerne, men har også en anden aktivitet: 00:02:56.629 --> 00:03:00.719 en exonucleus aktivitet. (exo betyder "ud" eller "udenfor", nucleus betyder "cellekerne", så exonucleus betyder "udenfor cellekernen") 00:03:00.719 --> 00:03:07.409 Så når enzymet støder på dobbeltstrenget DNA, vil det skille strengen, 00:03:07.409 --> 00:03:12.098 som er i vejen ad, og erstatte alle nukleotiderne. 00:03:12.098 --> 00:03:18.379 Bemærk at mens polymerasen passere gennem proben, bliver nukleotidet, som bærer den fluorescerende 00:03:18.379 --> 00:03:24.078 markør og nukleotidet der bærer quencheren adskilt fra hinanden. 00:03:24.078 --> 00:03:32.299 I mangel af en nærliggende quencher, kan det fluorescerende molekyle nu udsende målbart lys, når 00:03:32.299 --> 00:03:34.098 det bliver stimuleret. 00:03:34.098 --> 00:03:41.098 Hver gang en amplikon produceres, bliver endnu en fluorescerende markør frigivet fra dets naboliggende 00:03:41.098 --> 00:03:43.017 quencher. 00:03:43.017 --> 00:03:50.299 Derfor, ligesom at antallet af amplikoner fordobles i hver PCR-cyklus, bliver mængden af emitteret 00:03:50.299 --> 00:03:52.959 fluorescerende energi også fordoblet. 00:03:52.959 --> 00:04:00.059 Denne produktion af lys kan overvåges under PCR-reaktionen i et termisk cykliseringsapparat, der er udstyret 00:04:00.059 --> 00:04:02.012 med et fluorometer. 00:04:02.012 --> 00:04:08.689 Så hvis man starter med en klinisk prøve, der kun har én kopi af mål-DNA'et, kan det 00:04:08.689 --> 00:04:15.048 tage 40 eller flere cykler, før amplikonerne kan måles ved et fluorometer i et specialiseret 00:04:15.048 --> 00:04:16.048 termisk cykliseringsapparat. 00:04:16.048 --> 00:04:24.006 Derimod, hvis den oprindelige prøve indeholder 32 kopier af mål-DNA'et, så 00:04:24.006 --> 00:04:30.069 kan amplikonerne måles på fluorometeret efter 5 færre runder af PCR. 00:04:30.069 --> 00:04:38.003 Og hvis der er 1024 mål-DNA-sekvenser i den oprindelige prøve, så bliver det fluorescerende 00:04:38.003 --> 00:04:42.139 signal målbart 10 runder tidligere. 00:04:42.139 --> 00:04:48.025 Så mængden af specifik DNA i den kliniske prøve bestemmes ved 00:04:48.025 --> 00:04:56.819 runden af PCR, hvor mængden af fluorescens bliver målbar. 00:04:56.819 --> 00:05:04.043 RTPCR bliver oftest anvendt til at kvantificere mængden af virus i blodet hos patienter 00:05:04.043 --> 00:05:08.449 med HIV, Hepatitis B og andre vira. 00:05:08.449 --> 00:05:19.289 Men HIV er et RNA-virus, det har ingen DNA og RNA'et, som det har, er enkeltstrenget. 00:05:19.289 --> 00:05:23.059 Så hvordan kan denne metode virke? 00:05:23.059 --> 00:05:30.058 Svaret er, at RNA fra et RNA-virus, kan kvantificeres efter at det er blevet kopieret 00:05:30.058 --> 00:05:34.005 og omdannet til dobbeltstrenget DNA. 00:05:34.005 --> 00:05:42.389 Denne animation viser, hvordan dette opnås. Først bliver det virale RNA frigivet fra 00:05:42.389 --> 00:05:43.509 virionet. 00:05:43.509 --> 00:05:51.096 Derefter bliver en komplimentær DNA-streng syntetiseret ud fra det virale RNA med renset 00:05:51.096 --> 00:05:56.021 revers transkriptase, ligesom den gør i en naturlig replikation. 00:05:56.021 --> 00:06:06.016 I nogle protokoller, bliver et specialiceret RNAse enzym derefter tilsat for at gøre det muligt for RNA'et 00:06:06.016 --> 00:06:08.005 at blive nedbrudt. 00:06:08.005 --> 00:06:15.539 Ligemeget om dette er en del af proceduren eller ej, er det næste afgørende skridt, når en DNA-polymerase 00:06:15.539 --> 00:06:22.066 og en primer danner en komplimentær DNA-streng, ligesom i PCR-reaktionen. 00:06:22.066 --> 00:06:31.669 Ved afslutningen af denne reaktion, er et enkeltstrenget virus-RNA blevet omdannet til et dobbeltstrenget 00:06:31.669 --> 00:06:37.024 DNA, som har samme sekvens af nukleotidbaser. 00:06:37.024 --> 00:06:42.610 Den kvalitative PCR-reaktion kan forløbe som beskrevet tidligere.