1 00:00:02,031 --> 00:00:09,061 (Danish translation by Beatrix M. G. Nielsen, University of Copenhagen) Dette program viser, hvordan en specifik nukleinsyresekvens i en klinisk prøve kan spores 2 00:00:09,061 --> 00:00:12,539 og kvantificeres ved anvendelse af PCR (Polymerase Chain Reaktion, på dansk polymerasekædereaktion). 3 00:00:12,539 --> 00:00:19,949 Dette opnås ved at registrere akkumuleringen af de amplificerede PCR-produkter, som de bliver 4 00:00:19,949 --> 00:00:23,369 dannet i reaktionen. 5 00:00:23,369 --> 00:00:29,098 Derfor kaldes processen RealTid (Real-Time), eller RTPCR. 6 00:00:29,098 --> 00:00:38,059 For at forstå hvordan amplificerede PCR-produkter, også kaldet amplikoner, spores i realtid, 7 00:00:38,059 --> 00:00:46,047 så lad os først betragte de hændelser, som forekommer ved en normal cyklus af PCR-reaktionen. 8 00:00:46,047 --> 00:00:53,036 Husk, at det første trin i en PCR-cyklus er at øge reaktionstemperaturen og derved smelte 9 00:00:53,036 --> 00:00:55,094 dobbeltstrenget DNA. 10 00:00:55,094 --> 00:01:03,007 Så, når temperaturen sænkes, binder de specifikke primere til sekvenserne i 11 00:01:03,007 --> 00:01:06,084 hver ende af mål-DNA'et. 12 00:01:06,084 --> 00:01:15,007 Det mellemliggende DNA kan derefter syntetiseres ved polymerasereaktion i modsatte retninger. 13 00:01:15,007 --> 00:01:21,729 Som resultat producerer du to dobbelt-strengede kopier af mål-DNA'et, hvor du til at begyndte med 14 00:01:21,729 --> 00:01:23,028 kun havde én. 15 00:01:23,028 --> 00:01:30,229 Hvis en del af denne grundlæggende proces fovirrer dig, kan det være en god ide at gennemgå 16 00:01:30,229 --> 00:01:35,499 programmet om grundlæggende PCR igen. 17 00:01:35,499 --> 00:01:41,067 For at spore dannelsen af nye amplikoner i realtid, har PCR-reaktionen brug for 18 00:01:41,067 --> 00:01:50,017 noget yderligere - en enkeltstrenget DNA-probe, designet til at binde sig til en del af den 19 00:01:50,017 --> 00:01:54,329 DNA-sekvens, der bliver syntetiseret mellem de to primere. 20 00:01:54,329 --> 00:02:02,529 Men i modsætning til primerene, er denne probe mærket mere specifikt. En af dens 21 00:02:02,529 --> 00:02:11,005 nukleotider er mærket med et fluorescerende molekyle og et andet nucleotid er mærket 22 00:02:11,005 --> 00:02:16,004 med et fluorescerende quencher-molekyle. (to quench betyder "at slukke") 23 00:02:16,004 --> 00:02:23,059 Quencheren absorberer hurtigt al lysenergi, der udsendes af det fluorescerende molekyle, så længe 24 00:02:23,059 --> 00:02:27,459 molekylet forbliver meget tæt på quencheren. 25 00:02:27,459 --> 00:02:36,159 Lad os nu se, hvad der sker, når denne ekstra ingrediens er tilstede under en 26 00:02:36,159 --> 00:02:39,769 enkelt cyklus af PCR. 27 00:02:39,769 --> 00:02:44,099 Andre primere binder til de separate strenge af DNA. 28 00:02:44,099 --> 00:02:49,029 Proben finder også sin komplimentære sekvens imellem dem. 29 00:02:49,029 --> 00:02:56,629 Enzymet syntetiserer nyt DNA fra enderne af primerne, men har også en anden aktivitet: 30 00:02:56,629 --> 00:03:00,719 en exonucleus aktivitet. (exo betyder "ud" eller "udenfor", nucleus betyder "cellekerne", så exonucleus betyder "udenfor cellekernen") 31 00:03:00,719 --> 00:03:07,409 Så når enzymet støder på dobbeltstrenget DNA, vil det skille strengen, 32 00:03:07,409 --> 00:03:12,098 som er i vejen ad, og erstatte alle nukleotiderne. 33 00:03:12,098 --> 00:03:18,379 Bemærk at mens polymerasen passere gennem proben, bliver nukleotidet, som bærer den fluorescerende 34 00:03:18,379 --> 00:03:24,078 markør og nukleotidet der bærer quencheren adskilt fra hinanden. 35 00:03:24,078 --> 00:03:32,299 I mangel af en nærliggende quencher, kan det fluorescerende molekyle nu udsende målbart lys, når 36 00:03:32,299 --> 00:03:34,098 det bliver stimuleret. 37 00:03:34,098 --> 00:03:41,098 Hver gang en amplikon produceres, bliver endnu en fluorescerende markør frigivet fra dets naboliggende 38 00:03:41,098 --> 00:03:43,017 quencher. 39 00:03:43,017 --> 00:03:50,299 Derfor, ligesom at antallet af amplikoner fordobles i hver PCR-cyklus, bliver mængden af emitteret 40 00:03:50,299 --> 00:03:52,959 fluorescerende energi også fordoblet. 41 00:03:52,959 --> 00:04:00,059 Denne produktion af lys kan overvåges under PCR-reaktionen i et termisk cykliseringsapparat, der er udstyret 42 00:04:00,059 --> 00:04:02,012 med et fluorometer. 43 00:04:02,012 --> 00:04:08,689 Så hvis man starter med en klinisk prøve, der kun har én kopi af mål-DNA'et, kan det 44 00:04:08,689 --> 00:04:15,048 tage 40 eller flere cykler, før amplikonerne kan måles ved et fluorometer i et specialiseret 45 00:04:15,048 --> 00:04:16,048 termisk cykliseringsapparat. 46 00:04:16,048 --> 00:04:24,006 Derimod, hvis den oprindelige prøve indeholder 32 kopier af mål-DNA'et, så 47 00:04:24,006 --> 00:04:30,069 kan amplikonerne måles på fluorometeret efter 5 færre runder af PCR. 48 00:04:30,069 --> 00:04:38,003 Og hvis der er 1024 mål-DNA-sekvenser i den oprindelige prøve, så bliver det fluorescerende 49 00:04:38,003 --> 00:04:42,139 signal målbart 10 runder tidligere. 50 00:04:42,139 --> 00:04:48,025 Så mængden af specifik DNA i den kliniske prøve bestemmes ved 51 00:04:48,025 --> 00:04:56,819 runden af PCR, hvor mængden af fluorescens bliver målbar. 52 00:04:56,819 --> 00:05:04,043 RTPCR bliver oftest anvendt til at kvantificere mængden af virus i blodet hos patienter 53 00:05:04,043 --> 00:05:08,449 med HIV, Hepatitis B og andre vira. 54 00:05:08,449 --> 00:05:19,289 Men HIV er et RNA-virus, det har ingen DNA og RNA'et, som det har, er enkeltstrenget. 55 00:05:19,289 --> 00:05:23,059 Så hvordan kan denne metode virke? 56 00:05:23,059 --> 00:05:30,058 Svaret er, at RNA fra et RNA-virus, kan kvantificeres efter at det er blevet kopieret 57 00:05:30,058 --> 00:05:34,005 og omdannet til dobbeltstrenget DNA. 58 00:05:34,005 --> 00:05:42,389 Denne animation viser, hvordan dette opnås. Først bliver det virale RNA frigivet fra 59 00:05:42,389 --> 00:05:43,509 virionet. 60 00:05:43,509 --> 00:05:51,096 Derefter bliver en komplimentær DNA-streng syntetiseret ud fra det virale RNA med renset 61 00:05:51,096 --> 00:05:56,021 revers transkriptase, ligesom den gør i en naturlig replikation. 62 00:05:56,021 --> 00:06:06,016 I nogle protokoller, bliver et specialiceret RNAse enzym derefter tilsat for at gøre det muligt for RNA'et 63 00:06:06,016 --> 00:06:08,005 at blive nedbrudt. 64 00:06:08,005 --> 00:06:15,539 Ligemeget om dette er en del af proceduren eller ej, er det næste afgørende skridt, når en DNA-polymerase 65 00:06:15,539 --> 00:06:22,066 og en primer danner en komplimentær DNA-streng, ligesom i PCR-reaktionen. 66 00:06:22,066 --> 00:06:31,669 Ved afslutningen af denne reaktion, er et enkeltstrenget virus-RNA blevet omdannet til et dobbeltstrenget 67 00:06:31,669 --> 00:06:37,024 DNA, som har samme sekvens af nukleotidbaser. 68 00:06:37,024 --> 00:06:42,610 Den kvalitative PCR-reaktion kan forløbe som beskrevet tidligere.