(Danish translation by Beatrix M. G. Nielsen, University of Copenhagen) Dette program viser, hvordan en specifik nukleinsyresekvens i en klinisk prøve kan spores
og kvantificeres ved anvendelse af PCR (Polymerase Chain Reaktion, på dansk polymerasekædereaktion).
Dette opnås ved at registrere akkumuleringen af de amplificerede PCR-produkter, som de bliver
dannet i reaktionen.
Derfor kaldes processen RealTid (Real-Time), eller RTPCR.
For at forstå hvordan amplificerede PCR-produkter, også kaldet amplikoner, spores i realtid,
så lad os først betragte de hændelser, som forekommer ved en normal cyklus af PCR-reaktionen.
Husk, at det første trin i en PCR-cyklus er at øge reaktionstemperaturen og derved smelte
dobbeltstrenget DNA.
Så, når temperaturen sænkes, binder de specifikke primere til sekvenserne i
hver ende af mål-DNA'et.
Det mellemliggende DNA kan derefter syntetiseres ved polymerasereaktion i modsatte retninger.
Som resultat producerer du to dobbelt-strengede kopier af mål-DNA'et, hvor du til at begyndte med
kun havde én.
Hvis en del af denne grundlæggende proces fovirrer dig, kan det være en god ide at gennemgå
programmet om grundlæggende PCR igen.
For at spore dannelsen af nye amplikoner i realtid, har PCR-reaktionen brug for
noget yderligere - en enkeltstrenget DNA-probe, designet til at binde sig til en del af den
DNA-sekvens, der bliver syntetiseret mellem de to primere.
Men i modsætning til primerene, er denne probe mærket mere specifikt. En af dens
nukleotider er mærket med et fluorescerende molekyle og et andet nucleotid er mærket
med et fluorescerende quencher-molekyle. (to quench betyder "at slukke")
Quencheren absorberer hurtigt al lysenergi, der udsendes af det fluorescerende molekyle, så længe
molekylet forbliver meget tæt på quencheren.
Lad os nu se, hvad der sker, når denne ekstra ingrediens er tilstede under en
enkelt cyklus af PCR.
Andre primere binder til de separate strenge af DNA.
Proben finder også sin komplimentære sekvens imellem dem.
Enzymet syntetiserer nyt DNA fra enderne af primerne, men har også en anden aktivitet:
en exonucleus aktivitet. (exo betyder "ud" eller "udenfor", nucleus betyder "cellekerne", så exonucleus betyder "udenfor cellekernen")
Så når enzymet støder på dobbeltstrenget DNA, vil det skille strengen,
som er i vejen ad, og erstatte alle nukleotiderne.
Bemærk at mens polymerasen passere gennem proben, bliver nukleotidet, som bærer den fluorescerende
markør og nukleotidet der bærer quencheren adskilt fra hinanden.
I mangel af en nærliggende quencher, kan det fluorescerende molekyle nu udsende målbart lys, når
det bliver stimuleret.
Hver gang en amplikon produceres, bliver endnu en fluorescerende markør frigivet fra dets naboliggende
quencher.
Derfor, ligesom at antallet af amplikoner fordobles i hver PCR-cyklus, bliver mængden af emitteret
fluorescerende energi også fordoblet.
Denne produktion af lys kan overvåges under PCR-reaktionen i et termisk cykliseringsapparat, der er udstyret
med et fluorometer.
Så hvis man starter med en klinisk prøve, der kun har én kopi af mål-DNA'et, kan det
tage 40 eller flere cykler, før amplikonerne kan måles ved et fluorometer i et specialiseret
termisk cykliseringsapparat.
Derimod, hvis den oprindelige prøve indeholder 32 kopier af mål-DNA'et, så
kan amplikonerne måles på fluorometeret efter 5 færre runder af PCR.
Og hvis der er 1024 mål-DNA-sekvenser i den oprindelige prøve, så bliver det fluorescerende
signal målbart 10 runder tidligere.
Så mængden af specifik DNA i den kliniske prøve bestemmes ved
runden af PCR, hvor mængden af fluorescens bliver målbar.
RTPCR bliver oftest anvendt til at kvantificere mængden af virus i blodet hos patienter
med HIV, Hepatitis B og andre vira.
Men HIV er et RNA-virus, det har ingen DNA og RNA'et, som det har, er enkeltstrenget.
Så hvordan kan denne metode virke?
Svaret er, at RNA fra et RNA-virus, kan kvantificeres efter at det er blevet kopieret
og omdannet til dobbeltstrenget DNA.
Denne animation viser, hvordan dette opnås. Først bliver det virale RNA frigivet fra
virionet.
Derefter bliver en komplimentær DNA-streng syntetiseret ud fra det virale RNA med renset
revers transkriptase, ligesom den gør i en naturlig replikation.
I nogle protokoller, bliver et specialiceret RNAse enzym derefter tilsat for at gøre det muligt for RNA'et
at blive nedbrudt.
Ligemeget om dette er en del af proceduren eller ej, er det næste afgørende skridt, når en DNA-polymerase
og en primer danner en komplimentær DNA-streng, ligesom i PCR-reaktionen.
Ved afslutningen af denne reaktion, er et enkeltstrenget virus-RNA blevet omdannet til et dobbeltstrenget
DNA, som har samme sekvens af nukleotidbaser.
Den kvalitative PCR-reaktion kan forløbe som beskrevet tidligere.