0:00:02.031,0:00:09.061
(Danish translation by Beatrix M. G. Nielsen, University of Copenhagen)[br]Dette program viser, hvordan en specifik nukleinsyresekvens i en klinisk prøve kan spores

0:00:09.061,0:00:12.539
og kvantificeres ved anvendelse af PCR (Polymerase Chain Reaktion, på dansk polymerasekædereaktion).

0:00:12.539,0:00:19.949
Dette opnås ved at registrere akkumuleringen af de amplificerede PCR-produkter, som de bliver

0:00:19.949,0:00:23.369
dannet i reaktionen.

0:00:23.369,0:00:29.098
Derfor kaldes processen RealTid (Real-Time), eller RTPCR.

0:00:29.098,0:00:38.059
For at forstå hvordan amplificerede PCR-produkter, også kaldet amplikoner, spores i realtid,

0:00:38.059,0:00:46.047
så lad os først betragte de hændelser, som forekommer ved en normal cyklus af PCR-reaktionen.

0:00:46.047,0:00:53.036
Husk, at det første trin i en PCR-cyklus er at øge reaktionstemperaturen og derved smelte

0:00:53.036,0:00:55.094
dobbeltstrenget DNA.

0:00:55.094,0:01:03.007
Så, når temperaturen sænkes, binder de specifikke primere til sekvenserne i

0:01:03.007,0:01:06.084
hver ende af mål-DNA'et.

0:01:06.084,0:01:15.007
Det mellemliggende DNA kan derefter syntetiseres ved polymerasereaktion i modsatte retninger.

0:01:15.007,0:01:21.729
Som resultat producerer du to dobbelt-strengede kopier af mål-DNA'et, hvor du til at begyndte med

0:01:21.729,0:01:23.028
kun havde én.

0:01:23.028,0:01:30.229
Hvis en del af denne grundlæggende proces fovirrer dig, kan det være en god ide at gennemgå

0:01:30.229,0:01:35.499
programmet om grundlæggende PCR igen.

0:01:35.499,0:01:41.067
For at spore dannelsen af nye amplikoner i realtid, har PCR-reaktionen brug for

0:01:41.067,0:01:50.017
noget yderligere - en enkeltstrenget DNA-probe, designet til at binde sig til en del af den

0:01:50.017,0:01:54.329
DNA-sekvens, der bliver syntetiseret mellem de to primere.

0:01:54.329,0:02:02.529
Men i modsætning til primerene, er denne probe mærket mere specifikt. En af dens

0:02:02.529,0:02:11.005
nukleotider er mærket med et fluorescerende molekyle og et andet nucleotid er mærket

0:02:11.005,0:02:16.004
med et fluorescerende quencher-molekyle. (to quench betyder "at slukke")

0:02:16.004,0:02:23.059
Quencheren absorberer hurtigt al lysenergi, der udsendes af det fluorescerende molekyle, så længe

0:02:23.059,0:02:27.459
molekylet forbliver meget tæt på quencheren.

0:02:27.459,0:02:36.159
Lad os nu se, hvad der sker, når denne ekstra ingrediens er tilstede under en

0:02:36.159,0:02:39.769
enkelt cyklus af PCR.

0:02:39.769,0:02:44.099
Andre primere binder til de separate strenge af DNA.

0:02:44.099,0:02:49.029
Proben finder også sin komplimentære sekvens imellem dem.

0:02:49.029,0:02:56.629
Enzymet syntetiserer nyt DNA fra enderne af primerne, men har også en anden aktivitet:

0:02:56.629,0:03:00.719
en exonucleus aktivitet. (exo betyder "ud" eller "udenfor", nucleus betyder "cellekerne", så exonucleus betyder "udenfor cellekernen")

0:03:00.719,0:03:07.409
Så når enzymet støder på dobbeltstrenget DNA, vil det skille strengen,

0:03:07.409,0:03:12.098
som er i vejen ad, og erstatte alle nukleotiderne.

0:03:12.098,0:03:18.379
Bemærk at mens polymerasen passere gennem proben, bliver nukleotidet, som bærer den fluorescerende

0:03:18.379,0:03:24.078
markør og nukleotidet der bærer quencheren adskilt fra hinanden.

0:03:24.078,0:03:32.299
I mangel af en nærliggende quencher, kan det fluorescerende molekyle nu udsende målbart lys, når

0:03:32.299,0:03:34.098
det bliver stimuleret.

0:03:34.098,0:03:41.098
Hver gang en amplikon produceres, bliver endnu en fluorescerende markør frigivet fra dets naboliggende

0:03:41.098,0:03:43.017
quencher.

0:03:43.017,0:03:50.299
Derfor, ligesom at antallet af amplikoner fordobles i hver PCR-cyklus, bliver mængden af emitteret

0:03:50.299,0:03:52.959
fluorescerende energi også fordoblet.

0:03:52.959,0:04:00.059
Denne produktion af lys kan overvåges under PCR-reaktionen i et termisk cykliseringsapparat, der er udstyret

0:04:00.059,0:04:02.012
med et fluorometer.

0:04:02.012,0:04:08.689
Så hvis man starter med en klinisk prøve, der kun har én kopi af mål-DNA'et, kan det

0:04:08.689,0:04:15.048
tage 40 eller flere cykler, før amplikonerne kan måles ved et fluorometer i et specialiseret

0:04:15.048,0:04:16.048
termisk cykliseringsapparat.

0:04:16.048,0:04:24.006
Derimod, hvis den oprindelige prøve indeholder 32 kopier af mål-DNA'et, så

0:04:24.006,0:04:30.069
kan amplikonerne måles på fluorometeret efter 5 færre runder af PCR.

0:04:30.069,0:04:38.003
Og hvis der er 1024 mål-DNA-sekvenser i den oprindelige prøve, så bliver det fluorescerende

0:04:38.003,0:04:42.139
signal målbart 10 runder tidligere.

0:04:42.139,0:04:48.025
Så mængden af specifik DNA i den kliniske prøve bestemmes ved

0:04:48.025,0:04:56.819
runden af PCR, hvor mængden af fluorescens bliver målbar.

0:04:56.819,0:05:04.043
RTPCR bliver oftest anvendt til at kvantificere mængden af virus i blodet hos patienter

0:05:04.043,0:05:08.449
med HIV, Hepatitis B og andre vira.

0:05:08.449,0:05:19.289
Men HIV er et RNA-virus, det har ingen DNA og RNA'et, som det har, er enkeltstrenget.

0:05:19.289,0:05:23.059
Så hvordan kan denne metode virke?

0:05:23.059,0:05:30.058
Svaret er, at RNA fra et RNA-virus, kan kvantificeres efter at det er blevet kopieret

0:05:30.058,0:05:34.005
og omdannet til dobbeltstrenget DNA.

0:05:34.005,0:05:42.389
Denne animation viser, hvordan dette opnås. Først bliver det virale RNA frigivet fra

0:05:42.389,0:05:43.509
virionet.

0:05:43.509,0:05:51.096
Derefter bliver en komplimentær DNA-streng syntetiseret ud fra det virale RNA med renset

0:05:51.096,0:05:56.021
revers transkriptase, ligesom den gør i en naturlig replikation.

0:05:56.021,0:06:06.016
I nogle protokoller, bliver et specialiceret RNAse enzym derefter tilsat for at gøre det muligt for RNA'et

0:06:06.016,0:06:08.005
at blive nedbrudt.

0:06:08.005,0:06:15.539
Ligemeget om dette er en del af proceduren eller ej, er det næste afgørende skridt, når en DNA-polymerase

0:06:15.539,0:06:22.066
og en primer danner en komplimentær DNA-streng, ligesom i PCR-reaktionen.

0:06:22.066,0:06:31.669
Ved afslutningen af denne reaktion, er et enkeltstrenget virus-RNA blevet omdannet til et dobbeltstrenget

0:06:31.669,0:06:37.024
DNA, som har samme sekvens af nukleotidbaser.

0:06:37.024,0:06:42.610
Den kvalitative PCR-reaktion kan forløbe som beskrevet tidligere.